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目的:采用肿瘤患者自体外周血来源单个核细胞体外培养成为成熟的DC并加入患者自体的TDLN细胞中代替原有的受肿瘤抑制的DC,以研究TDLN细胞的抗肿瘤活性。方法:1分离与培养人外周血树突状细胞(DC);通过倒置显微镜下观察细胞生长及形态变化情况。通过扫描电镜观察DC的超微结构。2通过流式细胞技术测定从外周血中培养的树突状细胞的CD83、CD1α、CD80、CD86的阳性表达率。3取食管癌患者引流淋巴结组织进行体外培养,用流式细胞仪测定细胞免疫分子表型。4采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测试验中DC与TDLN以不同比例(1:12.5、1:25、1:50、1:100)与TE1共同作用不同时间(12h、24h、48h和72h)后,对TE1细胞增殖反应的抑制作用;检测TDLN单独与TE1共同作用不同时间(12h、24h、48h和72h)后,对TE1细胞增殖反应的抑制作用;检测(对照组)DC与TDLN以不同比例(1:12.5、1:25、1:50、1:100)与A375共同作用不同时间(12h、24h、48h和72h)后,对A375细胞增殖反应的抑制作用。5分别将TDLN细胞与成熟DC细胞(1:50)共培养3d,DC细胞培养至第7d时,收取培养上清,用ELISA法检测IL-12p70、IFN-γ和TNF-α含量。6采用RT-PCR法检测(实验组)DC与TDLN不同比例(1:12.5,1:25,1:50,1:100)与TE1共同作用后,TE1细胞Bcl-2、Bax、survivin等基因的表达变化;结果:1外周血单个核细胞来源DC的形态学外周血单个核细胞经GM-CSF、IL-4于体外诱导培养5d后,呈现典型未成熟树突状细胞形态,细胞体积较小,表面毛刺状突起较少,细胞成簇分布,呈集落样生长;加入TNF-α后1-2d,具有典型成熟特征的DCs,细胞体积较大,形态不规则,表面有大量细而长的树突状突起,细胞中可见数量不等的细胞集落形成。2电镜下观察可见,未加入肿瘤坏死因子的细胞体积增大不明显,表面有部分细小的突起,呈现未成熟树突状细胞的形态;而加入TNF-α组细胞体积有所增大,表面毛刺状突起也明显增多,可见成熟的树突状细胞形态。3流式细胞仪结果显示,将外周血单个核细胞于体外诱导培养第7d时,加入TNF-α组,细胞呈CD80、CD86双阳性率可达56.97±3.92%,未加入TNF-α组DC表面CD80、CD86双阳性率仅为24.88±6.23 %,两组间有统计学差异(P<0.05);加入TNF-α组DC的CD1α、CD83双阳性表达率分别为42.60±7.08%,未加入TNF-α组DC的CD1α、CD83双阳性表达率28.56±12.45%,两组间有统计学差异(p<0.05)。4流式细胞术分析结果显示,TDLN细胞主要由CD3+T细胞和CD83+成熟树突细胞组成,其中CD3的阳性率为79.91±4.97%,CD83的阳性率为21.36±4.33%。进一步分析的结果显示,在CD3+T细胞中含有CD4的细胞阳性率为43.12±5.41%、CD8的细胞阳性率为38.76±4.83%。5 MTT分析结果显示,DC与TNLD以1:50作用12、24、48、72小时,对TE1细胞增殖有明显的抑制作用。其中两者比例为1:50,作用24小时,的抑制率最大(为49.57±0.98%),DC与TNLD以不同比例作用之间,对TE1细胞增殖的抑制率具有显著性差异(p<0.05)。6 MTT分析结果显示,DC与TNLD以任何比例作用12、24、48、72小时,对A375细胞增殖抑制率没有统计学差异。7 ELISA法检测结果显示DCTDNL和DC细胞培养上清中IL-12、IFN-γ和TNF-α的分泌水平,按1×10~6个DC/ml计算,三组DC上清中均能检测到IL-12、IFN-γ和TNF-α的分泌,DCTDNL组上清中IL-12、IFN-γ和TNF-α表达量高于DC组中IL-12、IFN-γ和TNF-α表达量,差异有统计学意义(p<0.05)。8 RT-PCR技术检测显示,DC与TLND以不同比例(1:12.5、1:25、1:50、1:100)作用24h后,TE1细胞内抗凋亡基因bcl-2、survivin表达水平均明显降低,bax表达水平均明显升高。以1:50比例作用时,TE1细胞内抗凋亡基因bcl-2、survivin表达最低,凋亡基因bax表达最高(p<0.05)。结论:1 HES (羟乙基淀粉)沉降法和密度梯度离心Ficoll法联合分离、收集DC细胞,经GM-CSF、IL-4和TNF-α联合于体外培养7d,可收获纯度较高的成熟DC。2加入TNF-α因子组,DC呈成熟形态,CD83、CD1α、CD80、CD86的阳性表达率高,提示TNF-α是刺激DC成熟的关键因子。3组织培养法收集TDLN细胞,体外经IL-2共培养14d,可收获功能完善、纯度较高的TDLN。4不同比例的DCTDLN细胞对TE1细胞杀伤能力均大于对A375细胞的杀伤能力,提示TDLN细胞可能在体内已被致敏,有一定的特异性识别能力,而添加DC可提高的是TDLN细胞的特异性杀伤能力。5 DCTDLN细胞对TE1细胞的杀伤率与效靶比的变化有关,DC与TNLD以1:50比例作用时杀伤率最高,与其他各比例相比,有统计学意义p<0.05,提示DCTDLN细胞的特异性杀伤能力存在剂量效应,6 DCTDLN细胞对TE1细胞的杀伤率随时间的不同而变化,作用24h杀伤率最高,与其他各作用时间组比较,有统计学意义p<0.05,提示TDLN细胞的特异性杀伤能力存在时间效应,7体外培养成熟的DC代替TDLN中原有的受肿瘤抑制的DC增强了TDLN的抗肿瘤活性,有可能作为一种有效的过继性细胞免疫治疗的新方法。