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【背景】胰腺癌以侵袭性强，转移早为特点，早期症状隐匿，5年生存率仅为4%。目前能够有效治疗胰腺癌的方法是手术切除，但是，由于诊断延误等原因，80%～85%的病人在发现肿瘤时已经丧失了最佳手术时机。因此寻找胰腺癌早期诊断的分子标记物和治疗靶点具有重要意义。小G蛋白Ran属于RAS超家族的一员,早期研究证明Ran在细胞生理过程中发挥了重要作用，主要包括参与调节核浆物质转运，纺锤体组装，调控核膜装配，调控细胞周期等。此外，近年来一些研究还发现Ran在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。【目的】1.检测Ran在胰腺癌组织和细胞中的表达，分析其与临床病理参数间的关系。2.研究Ran对胰腺癌细胞生长增殖能力的影响。3.研究Ran对胰腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。4.探讨Ran影响胰腺癌细胞增殖及转移能力的机制。【方法】1. Ran蛋白在胰腺癌组织及细胞中的表达检测（1）免疫组织化学方法检测Ran在胰腺癌组织及其对应的癌旁组织中的表达和分布，分析Ran在胰腺癌中的表达强度与临床病理参数之间的关系。（2）Western blot检测Ran在胰腺癌细胞系中的表达情况。2. Ran对胰腺癌细胞增殖能力的影响（1）构建3组Oligo Ran siRNA(small interfering RNA)，利用脂质体LipofectamineTM2000转染入高表达Ran细胞系，利用Western blot选出干扰效率最高的序列进行慢病毒载体包装。（2）慢病毒载体分别携带Ran shRNA干扰片段与无关序列片段，感染进入高表达Ran的胰腺癌细胞中，建立成功敲除Ran表达的细胞系及对照组细胞系。分别利用Western blot及qRT-PCR在蛋白水平及mRNA水平检测各组细胞Ran的表达情况，评估病毒干扰效率。（3）四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、平板克隆法、流式细胞术（Flow cytometry，FCM）检测下调Ran表达后对胰腺癌细胞体外增殖及凋亡能力的影响。（4）裸鼠皮下成瘤实验观察Ran表达下调后对胰腺癌细胞体内增殖能力的影响。3. Ran对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响（1）利用Transwell法，细胞刮擦实验观察下调Ran表达后对胰腺癌细胞体外侵袭迁移能力的影响。（2）裸鼠尾静脉转移实验，观察下调Ran表达后对胰腺癌细胞体内转移能力的影响。4. Ran调控胰腺癌细胞增殖及转移的机制研究（1）利用Western blot检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白在各组细胞中的表达情况。（2）利用转录因子PCR芯片及肿瘤转移PCR芯片筛选可能受到Ran调控的下游分子,明确可能的信号通路。【结果】（1）Ran在62例胰腺癌组织中表达强度均为阳性，阳性率明显高于其对应的癌旁组织(P<0.01)，且Ran的表达强度与胰腺癌的分期、转移密切相关。在Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌中Ran的表达强度明显高于Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌（P=0.039）；在发生远处转移的胰腺癌组织中Ran的表达强度明显高于未发生转移的胰腺癌组织（P=0.006）。在4种胰腺腺癌细胞系中检测Ran的表达情况，发现其在细胞系PANC-1及ASPC-1中高表达，在细胞系PC-3及BxPC-3中低表达。（2）构建3组Ran特异性干扰RNA序列Oligo Ran siRNA(siRan-1、siRan-2、siRan-3)以及无关序列对照组Oligo siRNA (Negative Control siRNA)，利用脂质体LipofectamineTM2000转染入高表达Ran的细胞系。通过Western blot检测，发现Oligo siRan-1干扰效果最佳，将其制成慢病毒载体携带的干扰片段RanshRNA，稳定感染进入高表达Ran的细胞系PANC-1、ASPC-1。通过Western blot和qRT-PCR验证Ran在蛋白水平及mRNA水平的表达情况，发现已成功建立敲除Ran的细胞系PANC-1/shRan、ASPC-1/shRan及对照组PANC-1/Ctr-shRNA、ASPC-1/Ctr-shRNA。（3）体外实验发现成功敲除Ran表达的细胞PANC-1/shRan、ASPC-1/shRan与对照组及亲本细胞组相比，生长速度减慢，集落形成能力减弱，细胞周期被阻滞在G1期，且细胞凋亡数量明显增多(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验发现，敲除Ran表达的细胞成瘤能力明显减弱(P<0.05)。（4）Transwell及细胞刮擦实验检测发现，相比于对照组细胞来说，敲除Ran表达的细胞PANC-1/shRan、ASPC-1/shRan的迁移及侵袭能力明显减弱(P<0.05)。裸鼠尾静脉转移实验发现，敲除Ran表达的细胞转移至肝脏的能力明显减弱(P<0.05)。（5）利用Western blot检验细胞周期、细胞凋亡相关分子发现，敲除Ran表达的细胞PANC-1/shRan与亲本细胞及对照组细胞相比，细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4以及磷酸化-Rb（Phospho-Rb，P-Rb）蛋白表达下降；Rb、P53及P21蛋白无明显变化；生存素Survivin表达下调；并且激活了凋亡蛋白Caspase-3，使cleaved Caspase-3表达增高。说明Ran可能通过调控以上关键效应分子引起细胞周期阻滞及细胞凋亡。（6）利用高通量的转录因子PCR芯片，肿瘤转移PCR芯片筛选出可能受到Ran调控的下游关键分子。在肿瘤转移芯片中可信度较高且表达下调2倍以上的分子有9个；在转录因子芯片中可信度较高且表达下调2倍以上的分子有7个。【结论】Ran在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且其高表达与胰腺癌的分期及转移成正相关。体外细胞功能实验发现，在高表达Ran的胰腺癌细胞中下调其表达，可引起细胞生长速度减慢，单克隆形成能力减弱，细胞周期阻滞，细胞凋亡增加，细胞迁移及侵袭能力明显下降；在体内可引起胰腺癌细胞成瘤能力及转移能力减弱。机制研究发现，下调Ran的表达引起的细胞周期阻滞及细胞凋亡可能是通过下调细胞周期相关蛋白CyclinA、Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4、P–Rb及存活素Survivin表达；并且激活了凋亡蛋白Caspase-3，使cleaved Caspase-3表达增高所引起的。利用高通量的转录因子PCR芯片，肿瘤转移PCR芯片筛选出可能受Ran调控的下游关键分子。在肿瘤转移芯片中可信度高且表达下调2倍以上的有分子有9个；在转录因子芯片中可信度高且表达下调2倍以上的分子有7个。