【摘 要】
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单核苷酸多态性（SNPs）是最常见的人类可遗传变异,包括单碱基转换、颠换等,在各类多态性中占80%左右。SNP位点数在人类基因组中可能达到了300万,并且与人类各类疾病密切相关。因此实现SNP的精准检测变得尤为关键,逐渐成为了当下化学生物学、医学等前沿学科研究的热点。为了实现单碱基突变的检测,近年测序型检测和非测序型检测发展迅猛。二代测序成本随着测序技术的高速发展而大幅度降低,但测序技术仍存在一些
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单核苷酸多态性（SNPs）是最常见的人类可遗传变异,包括单碱基转换、颠换等,在各类多态性中占80%左右。SNP位点数在人类基因组中可能达到了300万,并且与人类各类疾病密切相关。因此实现SNP的精准检测变得尤为关键,逐渐成为了当下化学生物学、医学等前沿学科研究的热点。为了实现单碱基突变的检测,近年测序型检测和非测序型检测发展迅猛。二代测序成本随着测序技术的高速发展而大幅度降低,但测序技术仍存在一些弊端,如对核酸浓度需求大、分析时间长,而且检测的准确性由于受到测序深度和选用的核酸酶等限制,导致低丰度突变样品的检测难度加大。随着早期诊断这一概念的提出,第二代测序技术越来越不能满足检测的要求,因此研发简便、快速而精准的低丰度单碱基突变的非测序检测手段逐渐成为了新的热点方向。SNP的非测序型检测方法主要分为两点:第一点是需要对SNP位点进行识别;另一点就是扩增,实现低丰度突变的检测。在生命体的新陈代谢过程中,DNA连接酶起着十分重要的作用,它可以催化DNA序列的分子内或分子间毗邻的3’-端羟基基团和5’-端磷酸基团生成磷酸二酯键,从而将片段DNA进行连接,完成DNA复制、修复以及重组的最后一步——连接。因此我们选定了DNA连接酶用于识别SNP位点,通过PCR技术放大连接产物,荧光实时定量,实现SNP位点的精准检测。源自T4噬菌体的T4 DNA连接酶由于应用范围广、反应条件温和、效率高并且价格低廉使其成为当下许多实验都直接使用的一种工具酶,使用成本极低。综合各方面考虑,我们决定利用T4 DNA连接酶辅助q-PCR法进行SNP低丰度检测。我们利用T4 DNA连接酶的单碱基突变识别功能,对其实验条件不断优化,最终导致在连接反应阶段制备PCR所需的二次模板N1-N2的产量不同,进行后续PCR实验时两种样品的扩增曲线出现差异,就能够直观的识别存在错配碱基对的样品,实现单碱基突变的检测。我们将这种T4 DNA连接酶辅助PCR的低丰度单碱基突变检测技术称为L-PCR。经过对肺鳞状细胞癌相关的数十种突变基因的检测,证实我们这种L-PCR方法检测突变基因低丰度的可行性,最低能够检测到0.1%的突变型基因。
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