黏菌素（Colistin,COL）是阳离子多肽类抗菌药物,是治疗多重耐药（MDR）菌特别是耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌感染的最后一道防线。而随着黏菌素使用的增长,细菌黏菌素耐药性正在世界范围内日益增长,现已成为全球关注的焦点。研制具有新作用靶点的新抗菌药异常艰难,而逆转耐药性的联合用药是与MDR细菌斗争的经济有效策略。联合用药可利用药物间的协同作用,大幅提高抗菌疗效,克服细菌耐药性,减缓耐药性发展。本研究将具有抑制外排泵功能的中药活性单体粉防己碱（Tetrandrine,TET）和金属螯合剂EDTA与黏菌素联用,尝试在分离沙门菌中证实两者能够协同逆转沙门菌黏菌素的耐药性,并研究其联用协同逆转沙门菌黏菌素耐药性的分子机制,探寻控制黏菌素耐药菌感染的新策略,以期为临床联合用药控制耐药性沙门菌感染提供科学依据。体外联合药敏试验发现,1/4×MIC TET可使COL对分离沙门菌的最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concertration,MIC）由0.25～4μg/m L降至0.008～4μg/m L,降低了1～≥256倍,1/4×MIC EDTA可使COL对分离沙门菌的MIC由0.25～4μg/m L降至0.008～2μg/m L,降低了2～128倍,并分别使83.33%、77.78%的沙门菌由COL耐药逆转为敏感。1/4×MIC TET+1/4×MIC EDTA+COL三药联合后逆转率高达100%,并使COL的MIC降低了4～2048倍远远大于TET、EDTA单独与COL联用时的下降倍数之和,表现出显著的协同逆转作用。棋盘试验结果显示,TET或EDTA分别与COL联用对耐药菌株的FIC平均值分别为0.50和0.47,均呈现协同抗菌作用。时间-杀菌曲线测定表明1/4×MIC TET+1/4 MIC EDTA+1/2×MIC COL在4h直接将细菌杀灭,验证了TET和EDTA与COL联合用药具有协同逆转效应。构建小鼠腹腔感染模型进行体内验证,结果显示TET+EDTA+COL三药联合可使小鼠脾脏和肝脏中的细菌载量分别显著下降了3.25和2.76 log10（CFU/g）,说明该组合在体内同样有协同逆转作用。本研究主要从细胞膜通透性、外排泵活性、氧化损伤等方面研究TET+EDTA+COL三药联合对mcr-1阳性沙门菌协同逆转作用的分子机制。借助荧光探针法研究发现,TET+EDTA+COL三药联合时荧光探针NPN的荧光强度显著增强,而荧光探针PI的荧光强度无显著变化,表明它们的联合作用导致细胞外膜通透性显著增加,但对细胞内膜没影响,扫描电镜图直观形象的证实了TET和EDTA与COL联用对细菌细胞外膜的破坏损伤作用。同时还发现三药联合时可引起荧光探针Di SC3（5）和BCECF-AM荧光强度的上升,表明它们的联合可以同时破坏跨膜电位和p H梯度,进而可以完全破坏沙门菌的质子动力。外排泵活性检测结果表明,TET+COL及TET+EDTA+COL组的荧光强度均显著升高,而EDTA+COL组荧光强度无显著变化,说明在TET的存在下均可显著抑制细菌外排泵的活性。通过DCFH-DA荧光染色观察菌体细胞中活性氧（ROS）变化,结果显示它们的联合能够诱导胞内ROS大幅度增加,进而加速菌体氧化损伤,导致菌体死亡。应用RT-PCR技术检测TET+EDTA+COL三药联合对黏菌素抗性基因mcr-1及外排泵Acr AB-Tol C相关基因转录水平的影响,进一步深入分析它们联合对mcr-1阳性沙门菌协同逆转作用的分子机制。结果表明,它们的联合使mcr-1的m RNA相对表达量降低了3.58倍,同时还下调了外排泵相关基因acr A、acr B、tol C及正向调控基因mar A m RNA的相对表达量,分别降低了2.50、5.79、1.85和3.40倍。借助计算机模拟技术分子对接进一步阐明了TET与MCR-1蛋白及其突变体之间的互作机制,首次发现粉防己碱是一种有效的MCR-1抑制剂。TET通过氢键与MCR-1上的关键氨基酸残基Tyr476、Leu419和Ala420相互作用,对接位点位于MCR-1的活性区域,导致蛋白空间构象发生改变,从而抑制其蛋白的生物活性。同时,还发现TET可以通过氢键或π-π键分别与MCR-1.2、MCR-1.3和MCR-1.6等突变体相互作用,结合能分别为-7.82、-7.02和-7.23 kcal/mol,表明TET与MCR-1突变体具有较好结合稳定性。综上所述,TET和EDTA与COL联合在体外和体内均能协同逆转沙门菌黏菌素耐药性,其分子机制主要是增强细胞外膜通透性、抑制外排泵功能、加速氧化损伤和下调mcr-1及外排泵Acr AB-Tol C相关基因的表达。我们的研究结果表明,TET和EDTA作为一种新型黏菌素佐剂,突出了非抗生素药物对抗耐黏菌素沙门菌的巨大潜力,为制定对耐黏菌素沙门菌感染的联合治疗方案提供依据。