隐孢子虫（Cryptosporidium）是全球重要的人兽共患病原,导致人体和动物严重腹泻,影响人类健康和畜牧业健康发展。研究表明,miRNAs调节隐孢子虫感染后细胞内信号通路的激活、抗菌分子的产生、细胞因子/趋化因子的表达、以及免疫稳态的反馈调节等多个反应阶段。课题组研究显示,微小隐孢子虫（C.parvum）感染早期HCT-8细胞miR-181d表达显著下调并推测其可能参与细胞凋亡调节过程并影响C.parvum)荷虫量。课题组前期已对miR-181d与B淋巴细胞瘤-2基因（B-celllymphoma-2,Bc12）进行了互作验证,证实Bc12分子为miR-181d靶基因。因此,本课题研究了 miR-181d及其靶基因Bc12对C.parvum感染后HCT-8细胞凋亡的影响并探索了凋亡途径,为设计开发抗隐孢子虫病药物靶标提供基础。1.miR-181d及其靶基因Bc12抗C.parvum感染研究为研究miR-181d及Bc12与隐孢子虫感染的关系,本研究检测了它们对隐孢子虫胞内增殖以及细胞凋亡的影响。试验首先构建了 pcDNA3.1-Bc12过表达载体,设计合成干扰Bc12的特异性siRNA以及miR-181d特异性mimic（模拟物）和inhibitor（抑制剂）。利用Lipofectamine3000转染试剂分别将Bc12过表达载体、siRNA、mimic和inhibitor及其相应对照试剂分别转染至HCT-8细胞,在转染后24 h感染C.parvum子孢子,于虫体感染后2 h和24 h检测HCT-8细胞中荷虫量变化。qPCR检测结果显示,感染2h后各组的荷虫量均无显著变化。感染24h后,Bc12过表达组以及miR-181d inhibitor组细胞荷虫量显著升高,而siBc12及miR-181d mimic组细胞荷虫量显著下降。于感染后24 h检测细胞凋亡,结果显示,Bc12过表达组以及miR-181 d inhibitor组细胞凋亡率均显著下降,siRNA和mimic组细胞凋亡比率均显著升高。以上试验表明miR-181d及Bc12能够通过促进HCT-8细胞凋亡来降低隐孢子虫在细胞内的增殖,以此抵御隐孢子虫感染。2.miR-181d及其靶基因Bc12调控C.prrvum感染后HCT-8细胞凋亡途径研究为研究C parvum感染宿主细胞后是否通过线粒体凋亡途径调控细胞凋亡。通过qPCR方法检测miR-181d、Bc12及线粒体依赖凋亡途径相关分子Bax、Puma、Caspase 9、Caspase 3在隐孢子虫感染HCT-8细胞后不同时间点的表达,发现在感染前期（0-24h）miR-181d表达降低,Bc12表达显著升高,感染后期（36-48h）miR-181d表达升高,Bc12表达降低。而促凋亡分子Bax、Puma、Caspase9、Caspase 3等基本与Bc12表达呈趋势相反。使用Lipofectamine3000转染试剂将Bc12过表达载体、阴性对照空载体、siRNA及其阴性对照、miR-181d mimic和inhibitor及其阴性对照,分别转染至HCT-8细胞,于转染后24h感染C.parvum子孢子,检测各组中Bc12、Bax、Puma、Caspase9、Caspase3等分子的相对表达量。qPCR和WB分析结果显示,转染Bc12过表达载体组以及miR-181d inhibitor组中在感染早期（12h）和感染晚期（48h）Bc12的表达均显著升高,其他分子均差异性表达下降,而在siBc12组及miR-181d mimic组分子的表达呈现相反趋势,且具有显著性。说明C.parvum感染HCT-8细胞后通过miR-181d靶向Bc12激活线粒体凋亡途径调节细胞凋亡。miR-181d及Bc12表达的改变可影响线粒体凋亡通路分子的表达从而影响细胞凋亡。综上所述,miR-181d对入侵宿主细胞的C.parvum内生发育发挥重要影响。miR-181d靶向Bc12通过线粒体凋亡途径调节HCT-8细胞凋亡,进而影响C.parvum在感染细胞中的生长发育从而抵御隐孢子虫感染。