一、研究背景颅内动脉瘤(intracranial aneurysms,IAs)是一种脑血管退行性病变,其特征是颅内动脉血管局部异常扩张和管壁变薄形成的瘤样突起,其破裂出血导致的蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)具有较高的致死致残率。所以,IAs的早期诊断和治疗至关重要。流行病学研究显示,IAs的患病率为0.2%-9%,其1年和5年的破裂风险分别为1.4%和3.4%。目前认为,各种因素造成的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解、动脉血管壁稳态的破坏、炎症反应、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的凋亡和表型转化参与了IAs发生发展的病理生理过程。然而,IAs发生发展的具体机制尚不完全清楚,阐明IAs的发生、发展和破裂的相关分子机制,有助于我们寻求新的干预措施及治疗策略。伴随着各种炎性细胞的浸润、细胞因子和炎症因子的分泌,VSMCs将发生凋亡、增殖和表型转化,在IAs的发生发展和破裂过程中发挥重要的作用。研究发现,IAs组织中存在VSMCs丢失,在破裂IAs组织中发现大量的凋亡VSMCs。VSMCs有收缩表型和合成表型两种表型,其表型转化是指VSMCs由收缩表型转换为合成表型的过程。自噬可以调节VSMCs的表型转化,同时自噬在IAs的形成和破裂中发挥关键的作用。在未破裂和破裂的IAs组织中,微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)、自噬相关蛋白-5(autophagy related protein-5,ATG5)和Beclin-1等自噬相关基因的表达水平明显上调。因此,自噬诱导的VSMCs表型转化与IAs的形成密切相关。富含半耽氨酸的酸性分泌糖蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC),是广泛存在于多种组织器官细胞外基质中的一种分泌型糖蛋白。SPARC参与细胞迁移、增殖和凋亡、组织修复等多个生物学过程,与ECM的重塑、生长、细胞分化和伤口修复等过程有关,并且参与肿瘤、血管性疾病及代谢性疾病等多种疾病的病理生理过程。SPARC在IAs组织中表达明显上调,然而,SPARC参与IAs的形成和发展的具体机制尚不明确。SPARC可能通过以下途径参与IAs的形成和发展:(1)参与调控线粒体途径的凋亡:过表达SPARC可上调裂解的半胱天冬酶3(cleaved Caspase 3,CC3)和裂解的聚ADP核糖聚合酶(cleaved poly ADP-ribose polymerase,CPARP)的表达水平,启动线粒体途径的凋亡;(2)调控自噬:SPARC可诱导多种细胞的自噬增加;(3)调控糖脂代谢:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)患者的血管内皮细胞和VSMCs中的SPARC表达水平均明显上调,而己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)作为糖酵解途径中第一个限速酶,在As斑块中的表达明显减少。SPARC在2型糖尿病患者血浆中表达明显高于正常人,可负性调控HK2的表达从而影响肝癌细胞的糖酵解过程。ox-LDL和高糖均可诱导VSMCs表型转化,并参与IAs的形成。因此推测SPARC可能通过调控HK2表达进而影响VSMCs的生物学功能,参与IAs的发生;(4)抗粘附作用:SPARC具有显著的抗细胞间局部粘附的能力;(5)调控ECM:SPARC能够与ECM蛋白相互作用,促进细胞中的基质金属蛋白酶(如MMP-2、MMP-9等)的产生及其活性增加,调节ECM的重构;(6)调控炎症反应:SPARC可调控体内的多种炎症反应,SPARC表达增加表明血管壁正处于炎症状态,从而促进IAs的发生。综上所述,SPARC作为细胞外基质中的一种分泌型糖蛋白,有可能作为直接参与者影响了 IAs的发生发展,但对VSMCs的凋亡及表型转化的影响及具体作用机制尚不明确,仍需要进一步研究其中相关的分子机制及基因间的相互调控关系。基于以上研究背景,本课题研究了SPARC蛋白诱导人脑血管平滑肌细胞(human brain vascular smooth muscle cells,HBVSMCs)线粒体途径的凋亡和表型转化的作用及相关机制。我们首先分析了 SPARC体外处理HBVSMCs的mRNA表达谱变化,发现HK2基因表达明显下调,并可能参与了SPARC诱导的HBVSMCs凋亡。然后我们进一步应用免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减HK2基因、脂质体转染、RT-PCR、流式细胞术、Hoechst 33342/PI染色、JC-1 染色、透射电镜(transmission electron microscope,TEM)等技术方法证明了SPARC通过下调HK2表达调控HBVSMCs的线粒体途径凋亡。最后,我们应用免疫荧光染色、WB、siRNA敲减ATG5基因和脂质体转染、RT-PCR、Hoechst 33342/PI染色、自噬小体染色和TEM等技术方法证明了SPARC通过AMPK/mTOR通路诱导HBVSMCs的自噬增加,从而调控HBVSMCs的表型转化和凋亡。第一部分:SPARC处理后HBVSMCs全基因表达谱芯片检测及分析目的:通过检测SPARC处理后HBVMSCs全基因表达谱的变化,筛选出SPARC调控的HBVSMCs差异表达基因,探讨SPARC诱导HBVSMCs凋亡的分子机制。方法:1.光学显微镜下观察HBVSMCs形态和免疫荧光染色鉴定HBVSMCs的收缩表型。2.设对照组和SPARC(2 μ g/mL)处理组。SPARC处理24 h后,分别提取两组HBVSMCs的总RNA,通过全基因表达谱的检测,获取详细的原始数据和分析报告。3.评估芯片数据的质量,对表达谱芯片结果进行GO(Gene Ontology)分析、KEGG和BioCarta通路富集分析。4.随机选取差异表达明显的上调和下调基因进行RT-PCR验证芯片结果的可靠性。结果:1.培养至第5代的HBVSMCs在光学显微镜下呈纺锤形,有多个细胞突起;免疫荧光染色观察到收缩表型SMA和SM22-α均明显染色,细胞核呈圆形,可见与细胞长轴平行的纤维细丝。2.信号强度分布曲线、箱线图和主成分分析图显示显示芯片数据重复性较好,符合继续分析标准。散点图、火山图和聚类分析结果显示该芯片数据分布合理。本项目芯片共检测已知基因位点21449个,筛选出同时满足表达量变化|Fold Change|>1.5且P-value<0.05条件的差异基因共368个,其中表达上调165个,表达下调203个。3.GO分析显示,差异表达基因主要涉及到HBVSMCs解剖结构和形态、细胞生物的发育以及细胞骨架表达等生物学过程;KEGG和BioCarta通路富集分析显示参与差异表达基因的分子通路主要有丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、JAK-STAT信号通路、粘附斑途径等。4.RT-PCR验证随机选取的6个基因表达,其中5个基因的变化情况与芯片结果相符,表明该芯片结果具有较高的可靠性。5.结合芯片结果并通过大量的文献阅读,我们筛选出HK2在SPARC诱导HBVSMCs的凋亡中可能起重要作用。结论:1.SPARC处理可引起HBVSMCs基因表达谱变化,差异表达基因共368个,其中上调基因165个,下调基因203个。2.差异表达基因主要涉及到HBVSMCs解剖结构和形态、细胞生物的发育以及细胞骨架表达等生物学过程。富集的分子通路主要有MAPK通路、JAK-STAT通路、粘附斑途径等。3.SPARC可能通过下调HK2表达诱导HBVSMCs的线粒体途径凋亡,并可能通过诱导过度自噬促进HBVSMCs的凋亡。第二部分:SPARC通过下调HK2表达调控HBVSMCs的线粒体途径凋亡目的:探讨SPARC是否通过下调HK2表达诱导HBVSMCs的线粒体途径的凋亡。方法:1.应用免疫荧光染色和WB验证SPARC可诱导HBVSMCs的HK2表达下调。2.构建siRNA敲减HBVSMCs的HK2基因,并应用RT-PCR和WB检测其敲减效率,选取合适的敲减序列进行后续实验。3.分别应用Hoechst33342/PI双染、流式细胞术和WB法分别检测SPARC处理和HK2敲减对HBVSMCs凋亡及细胞周期的影响。4.应用JC-1染色分别检测SPARC处理和HK2敲减对HBVSMCs的线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的影响。5.应用TEM观察SPARC处理对HBVSMCs线粒体的损伤。结果:1.免疫荧光染色和WB结果显示,SPARC可调控HK2表达,诱导HBVSMCs的HK2表达下调。2.成功构建siRNA敲减HK2基因,RT-PCR和WB显示siRNA HK2 3#抑制作用最强,我们选取siRNA HK2 3#进行后续实验。3.Hoechst 33342/PI双染、流式细胞术和WB结果分别显示,SPARC处理和HK2敲减均可诱导HBVSMCs的凋亡;细胞周期检测显示,SPARC和HK2敲减均可改变HBVSMCs的细胞周期分布,将细胞阻滞于G0/G1期。4.JC-1染色显示,SPARC处理和HK2敲减均可降低HBVSMCs的MMP。5.TEM下可观察到SPARC处理导致HBVSMCs线粒体明显受损,表现为:线粒体肿胀、线粒体嵴断裂甚至消失。结论:1.SPARC诱导HBVSMCs中HK2的表达下调。2.SPARC诱导HBVSMCs的线粒体途径凋亡、抑制细胞周期、降低MMP并引起线粒体超微结构改变。3.HBVSMCs中的HK2基因敲减也可诱导HBVSMCs的线粒体途径凋亡、抑制细胞周期并降低MMP。4.HK2参与了SPARC诱导HBVSMCs的线粒体途径凋亡过程。第三部分:SPARC通过AMPK/mTOR介导的自噬调控HBVSMCs表型转化和凋亡目的:探讨SPARC处理后HBVSMCs的自噬水平变化及其与表型转化、细胞凋亡的关系。方法:1.应用免疫荧光染色、RT-PCR和WB检测SPARC诱导HBVSMCs的收缩表型基因(SMA、SM22-α)和合成表型基因(OPN)的表达变化。2.WB法检测不同浓度的SPARC处理以及处理后不同时间点诱导的HBVSMCs自噬相关基因LC3Ⅱ、p62、ATG5和Beclin-1的蛋白表达,选取本部分实验的最合适处理浓度和观察时间。3.应用共聚焦显微镜和TEM观察SPARC、3-MA对HBVSMCs的自噬小体数量的影响。并给予自噬抑制剂3-MA、溶酶体抑制剂CQ后检测SPARC诱导的HBVSMCs自噬流变化。4.WB法检测SPARC处理前后HBVSMCs通路蛋白p-AMPK和p-mTOR的表达情况,并检测给予AMPK抑制剂Compound C后p-AMPK、p-mTOR和自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62、ATG5 和 Beclin-1 的表达。5.构建siRNA敲减HBVSMCs的ATG5表达,并应用RT-PCR和WB检测其敲减效率,选取合适的敲减序列进行后续实验。应用WB检测ATG5敲减对SPARC处理的HBVSMCs自噬相关(LC3Ⅱ、p62、ATG5和Beclin-1)和凋亡相关(Bax、Bcl-2和CPARP)蛋白表达的影响;Hoechst 33342/PI双染法检测ATG5敲减对SPARC处理前后HBVSMCs凋亡的影响。6.WB法检测3-MA抑制自噬对SPARC处理前后HBVSMCs表型转化的影响。结果:1.免疫荧光染色、RT-PCR和WB法检测结果显示,SPARC诱导HBVSMCs收缩表型SMA、SM22-α表达下调,合成表型OPN表达上调,SPARC诱导了HBVSMCs的表型转化。2.WB检测显示,SPARC诱导HBVMSCs的自噬呈时间依赖性和剂量依赖性增加;共聚焦显微镜和TEM观察到SPARC诱导HBVSMCs的自噬小体增加,3-MA可部分阻止此过程。给予3-MA和CQ预处理结果显示,SPARC诱导HBVSMCs的自噬流增加。3.WB检测显示,SPARC处理诱导HBVSMCs的p-AMPK表达上调,而p-mTOR表达下调;CC抑制p-AMPK表达可部分阻止SPARC诱导的HBVSMCs的自噬增加。4.成功构建siRNA敲减ATG5基因,RT-PCR和WB显示siRNA ATG5 3#抑制作用最强,我们选取siRNA ATG5 3#进行后续实验。WB检测显示,ATG5基因敲减,可明显抑制SPARC诱导的HBVSMCs自噬增加,同时也抑制了SPARC诱导的HBVSMCs凋亡增加;Hoechst 33342/PI双染显示ATG5基因敲减可部分阻止SPARC诱导的HBVSMCs凋亡增加。5.WB检测显示,3-MA抑制自噬可部分阻止SPARC诱导的HBVSMCs表型转化。结论:1.SPARC诱导的自噬可介导HBVSMCs由收缩表型转化为合成表型,抑制自噬可部分阻止HBVSMCs的表型转化。2.SPARC诱导HBVSMCs的自噬增加和自噬流增加,此过程由AMPK/mTOR信号通路介导。3.SPARC诱导的HBVSMCs过度自噬导致HBVSMCs的凋亡,抑制自噬可部分阻止SPARC诱导的HBVSMCs凋亡。