缺血性脑损伤(中风)是临床上高发病之一,尽管脑缺血的损伤与保护机制一直是人们研究的重点,但是临床上对于脑缺血性中风,仍缺乏有效防治措施,目前越来越多的证据表明体内阿片系统在中风的机制中有重要作用。以往传统的阿片研究主要集中在阿片和内源性阿片肽对于痛感觉、情绪、自主功能、免疫调节具有广泛的生理和行为效应,最近,研究人员在缺血缺氧性神经元保护机理中发现DOR(delta-opioid receptors,DOR)的重要作用,DOR系统可能参与缺血缺氧神经元的保护和神经发生,例如:1.乌龟脑内独特的DOR高密度分布及其神经元的耐缺血缺氧性可能与神经元的缺血缺氧有关。2.DOR激动剂可以延长缺氧小鼠的存活时间,并且这种保护作用可以被DOR而非MOR,KOR的选择性受体拮抗剂所阻断。3.DOR激动剂可以减轻谷氨酸对培养的大脑皮层神经元兴奋性毒性损伤,活化MOR(mu-opioid receptor,MOR)和KOR(kappa-opioidreceptor,KOR)对谷氨酸所致神经元损伤无保护性作用。这些研究都支持,DOR在体内脑缺血缺氧神经元损伤及保护有重要作用。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子超家族的一员,BDNF在神经保护中有重要作用。在局灶性脑缺血,cAMP-反应元件结合蛋白(CREB)活化产生p-CREB可以提高BDNF的表达从而促进海马齿状回的神经保护。文献报道DOR激动剂DPDPE(D-Pen2,D-Pen5-enkephalin)能够快速激活CREB形成p-CREB,呈剂量依赖性,而且这种作用可被DOR特异性拮抗剂Naltrindole所拮抗。侧脑室给予非肽类的DOR激动剂(+)BW373U86可以提高BDNF mRNA在前脑皮层表达,并且这种效应可以被DOR拮抗剂Naltrindole所拮抗,而非MOR拮抗剂naltrexone和KOR拮抗剂nor-binaltorphimine。因此,在明确DOR参与神经元的缺血缺氧保护的基础上,研究DOR功能的改变对p-CREB/CREB及BDNF的影响,从而探讨DOR参与神经元的缺血缺氧保护的可能机制,是本课题研究的主要内容之一。针刺治疗中风在我国已有数千年的临床实践,早在《黄帝内经》、《甲乙经》中即有记载。长期以来针刺治疗中风取得了一定的效果,针刺作为中国传统医学的一个重要组成部分,针刺治疗中风,因其经济、有效、便利在全世界范围已得到专家患者的认可。大量研究表明,EA可以调节脑内阿片系统,而且近来也有文献报道:脑缺血前给予EA有缺血预保护作用,可以减低MCAO缺血再灌大鼠脑梗塞体积,而且这种保护作用,可以被腹腔注射DOR拮抗剂naltridole所拮抗,针刺可以提高缺血皮层的周边区BDNF表达,从而参与了脑缺血损伤的保护过程;我室以前的工作也表明针刺可以提高缺血和再灌时细胞外BDNF的水平,EA可以拮抗抑郁症模型中p-CREB表达的下降,并且提高BDNF的水平。因而,探讨针刺抗神经元的缺血缺氧损伤的神经保护作用是否与DOR有关,并且在此过程中是否有p-CREB/CREB及BDNF的参与,也是本课题研究的又一重要内容。大量研究表明,哺乳动物脑内终生存在神经发生,并且被脑缺血所加强。促进损伤区的神经再生替代死亡神经元已经成为缺血损伤治疗的潜在的有效的方法。文献报道,近来有研究表明,DOR可能与神经发生(增殖、迁移和分化)有关,在SVZ区,其神经元、神经胶质和少突胶质细胞亚群分别表达MOR、DOR、KOR。长期使用选择性DOR拮抗剂Naltrindole诱导大脑皮层前腹带区星型胶质细胞增生,DOR激动剂SNC80抑制星型胶质细胞增生。这些研究都支持DOR可能在神经发生中起重要作用。而EA可以加强大鼠局灶性脑缺血后纹状体的神经发生,以及提高BDNF的表达,因此,探讨DOR与EA在脑缺血非急性期神经保护与神经元发生中的作用及p-CREB/CREB和BDNF在其中的变化,是本课题研究的第三方面内容。综上所述,本课题拟在MCAO/再灌模型上,对DOR在脑缺血及针刺脑缺血的作用,作如下的系列探讨:1.明确DOR参与神经元的缺血缺氧保护的基础上,研究DOR功能的改变对p-CREB/CREB及BDNF的影响,从而探讨DOR参与神经元的缺血缺氧保护的可能机制。2.阐明EA抗神经元的缺血缺氧损伤的作用是否与DOR有关,并且探讨在此过程中是否有p-CREB/CREB及BDNF的参与。3.探讨脑缺血时DOR与EA的神经保护作用与神经发生的关系。实验结果如下:1.DOR在脑缺血/再灌注损伤的作用及与p-CREBICREB、BDNF的关系1.1 DOR激动剂TAN-67、拮抗剂Naltrindole对MCAO/再灌大鼠的影响大鼠随机分为8组:sham组,MCAO+aCSF组,MCAO+TAN-67 3 mM组,MCAO+TAN-67 6 mM组,MCAO+TAN-67 20 mM组,MCAO+Naltrindole 2 mM组,MCAO+Naltrindole 5 mM,MCAO+Naltrindole 10 mM组,缺血1hr再灌24hr。1.1.1 TAN-67、Naltrindole对大鼠局部脑血流的影响在MCAO术前侧脑室注射人工脑脊液,不同剂量的DOR激动剂(TAN-67,3mM,6 mM,20 mM)和拮抗剂(Naltrindole,2 mM,5mM,10 mM),通过侧脑室注射DiI检测侧脑室注射部位正确与否,用激光多普勒血流仪记录缺血侧皮层脑血流值。缺血前可以记录到稳定的血流基础值,因此,血流值可以用百分比来表示。所有动物均在缺血过程中和再灌30min时记录脑血流值,脑缺血发生后,顶叶皮层局部脑血流值骤然下降,仅为缺血前血流值的30%以下。在缺血持续的1h内,在该处血流值基本稳定在此低水平,甚至再灌时脑血流值也维持在低水平。侧脑室注射TAN-67(3 mM,6 mM,20 mM)、Naltrindole(2 mM,5 mM,10 mM)后,脑血流值与侧脑室注射aCSF缺血大鼠变化相似,维持在缺血前基础血流值的20-30%,提示药物并不影响缺血区皮层局部脑血流。1.1.2 TAN-67、Naltrindole对大鼠脑梗死体积的影响雄性SD大鼠,缺血1hr再灌24hr。应用Leica Q500图像处理系统,测定CV染色脑片的脑梗塞区域及损伤侧、对照侧半个脑片的面积脑梗死体积。结果显示,与缺血组相比,MCAO+TAN-67 6 mM明显降低梗死体积,然而MCAO+NAI 10mM则显著增加梗死体积。1.1.3 TAN-67、Naltrindole对大鼠神经功能缺损评分的影响缺血1hr再灌24hr,进行神经功能缺损评分,评分采用0-5级评分标准,结果显示,在所有缺血大鼠中MCAO+TAN-67 6 mM组评分最高,大鼠神经功能缺损程度最低,而MCAO+Naltrindole 10 mM组评分最低,大鼠神经功能缺损程度最高。1.1.4 TAN-67、Naltrindole对DOR蛋白表达的影响在TAN-67、Naltrindole对大鼠脑梗死体积影响的基础上,动物分为6组,MCAO组,MCAO+TAN67 6 mM组,TAN67 6mM组(不行MCAO手术),MCAO+Naltrindole 10 mM组,Naltrindole 10 mM group(不行MCAO手术)。雄性SD大鼠,缺血1hr再灌24hr,共聚焦显微镜显示DOR免疫阳性标记细胞形态为神经元样,脑内分布广泛,在非缺血侧皮层及纹状体高表达,在缺血侧皮层及纹状体表达下降。免疫荧光双标显示,DOR与MAP-2共存。Western blot分析显示,缺血1hr再灌24hr,DOR蛋白含量(36KD,60KD)在缺血侧纹状体表达下降。MCAO+NAI 10 mM组与缺血组相比DOR蛋白含量显著下降,MCAO+TAN-67 6 mM可以部分抑制MCAO所诱导的DOR蛋白表达下降;DOR蛋白(48KD)在缺血侧纹状体的表达没有变化。正常大鼠侧脑室注射Naltrindle 10 mM和TAN-67 6 mM后,与假手术组相比,DOR蛋白(36KD,48KD和60KD)表达没有显著性变化。1.2 DOR激动剂TAN-67、拮抗剂Naltrindole对MCAO大鼠p-CREB/CREB蛋白表达的影响雄性SD大鼠,缺血1hr再灌24hr,用共聚焦显微镜检查p-CREB(红色)/CREB(绿色),形态多为圆形或椭圆形,在脑内分布广泛,非缺血侧皮层及纹状体高表达,缺血侧皮层及纹状体表达下降。Western blot分析显示,缺血1h再灌24hr,p-CREB/CREB蛋白(43KD)含量在缺血侧纹状体表达下降。MCAO+NAI 10 mM组与缺血组相比,CREB蛋白表达显著下降,MCAO+TAN-67 6 mM可以部分抑制MCAO所诱导的CREB蛋白表达下降;正常大鼠侧脑室注射Naltrindle 10 mM和TAN-67 6 mM,与假手术组相比对CREB蛋白表达没有显著性差异,MCAO+TAN67 6 mM组,MCAO+NAI10 mM组与假手术组相比,p-CREB蛋白表达下降。1-3 DOR激动剂TAN-67、拮抗剂Naltrindole对MCAO大鼠BDNF蛋白表达的影响雄性SD大鼠,缺血1hr再灌24hr,用共聚焦显微镜检查BDNF免疫阳性标记细胞在脑内分布广泛,非缺血侧皮层及纹状体高表达,缺血侧皮层及纹状体表达下降。免疫荧光三标显示DOR、CREB和BDNF在神经元中共存。Western blot分析显示,缺血1hr再灌24hr,BDNF蛋白(21KD)含量在缺血侧纹状体表达下降。MCAO+NAI 10 mM与缺血组相比显著下降,MCAO+TAN-67 6mM可以部分抑制MCAO所诱导的BDNF蛋白表达下降;正常大鼠侧脑室注射Naltrindle 10 mM和TAN-67 6 mM,与假手术组相比对BDNF蛋白表达没有显著性差异。小结:1.DOR拮抗剂Naltrindole加重脑缺血损伤,激动剂TAN-67具有明显的神经保护效应,提示DOR可能具有内源性抗脑缺血损伤的神经保护作用。2.在大鼠缺血侧纹状体,胞浆内及细胞膜上DOR表达均有下降,DOR拮抗剂不改变胞浆内48KD DOR蛋白的表达,但进一步抑制了细胞膜上36KD和60KD DOR蛋白的表达,提示DOR蛋白在细胞内不同部位的表达与其神经保护效应的发挥可能有一定关系。3.脑缺血后纹状体内p-CREB、CREB及BDNF的表达均有下降,DOR拮抗剂可进一步下调CREB及BDNF的表达,DOR激动剂上调CREB及BDNF的表达,提示CREB及BDNF可能参与了DOR的抗脑缺血损伤效应。2.DOR在EA抗脑缺血中的作用及其与p-CREB/CREB和BDNF的关系大鼠分为5组,分别为:sham组,MCAO组,MCAO+EA组,MCAO+sham EA组和MCAO+2 mM Naltrindole+EA组。MCAO+EA所选择穴位是“水沟(GV 26)和内关(PC 6)”。2.1 EA,sham EA,MCAO,MCAO+2 mM Naltrindole+EA对大鼠脑梗死体积的影响雄性SD大鼠,缺血1hr再灌24hr,MCAO术前侧脑室注射2mM Naltrindole,灌注开始时给予EA治疗,持续30min,应用Leica Q500图像处理系统,测定CV染色脑片的脑梗塞区域及损伤侧、对照侧半个脑片的面积,并计算脑梗死体积。结果显示,与缺血组相比,EA降低梗死体积,NAI 2 mM翻转EA的抗脑缺血作用,增加梗死体积。sham EA没有抗脑缺血效应。与MCAO组相比,EA增加神经功能缺损评分,而MCAO+2mM Naltrindole神经功能缺损评分低。2.2 EA,MCAO,MCAO+2 mM Naltrindole+EA对大鼠DOR蛋白表达的影响Western blot分析显示:缺血1hr再灌24hr,DOR蛋白含量(36KD,60KD)在缺血侧纹状体表达下降,与sham组相比有明显差异,EA使DOR蛋白表达升高,NAI2 mM翻转EA升高DOR蛋白含量的作用(36KD,60KD)。不同组别间DOR蛋白含量(48KD)在缺血侧纹状体没有变化。2.3 EA,MCAO,MCAO+2 mM Naltrindole+EA对大鼠p-CREB/CREB蛋白表达的影响Western blot分析显示,缺血1hr再灌24hr,p-CREB/CREB蛋白(43KD)含量在缺血侧纹状体表达下降。EA可以使CREB蛋白表达上升;NAI 2 mM翻转EA升高缺血侧CREB蛋白含量的作用。与sham组相比,EA组、MCAO组、MCAO+Naltrindole 2 mM+EA组p-CREB表达均下降。2.4 EA,MCAO,MCAO+2 mM Naltrindole+EA对大鼠BDNF蛋白表达的影响Western blot分析显示,缺血1hr再灌24hr,BDNF蛋白(21KD)含量在缺血侧纹状体表达下降。EA可以使BDNF蛋白表达上升;NAI 2 mM翻转EA升高缺血侧BDNF蛋白含量的作用。与sham组相比EA组、MCAO组、MCAO+Naltrindole 2mM+EA组BDNF表达均下降。小结:1.EA“水沟、内关”具有明显的神经保护效应,DOR拮抗剂Naltrindole2mM能够翻转EA对MCAO缺血/再灌大鼠的神经保护作用,提示DOR可能是针刺抗脑缺血损伤中的一个重要环节。2.脑缺血后胞浆内及细胞膜上DOR表达下降,EA可明显上调细胞膜上DOR蛋白的表达,DOR拮抗剂则翻转EA对DOR表达的改变,提示EA的抗脑缺血损伤效应可能与其对DOR表达的改变有关。3.脑缺血后CREB、p-CREB及BDNF的表达均下降,EA可明显上调CREB和BDNF的表达,DOR拮抗剂翻转EA的作用,提示EA对CREB与BDNF的调节过程可能有DOR的参与。3.DOR和EA在神经发生中的作用大鼠随机分为7组:sham组,MCAO组,MCAO+EA组,MCAO+sham-EA组,MCAO+2 mM Naltrindole+EA组,MCAO+10 mM Naltrindole组,MCAO+6 mMTAN-67组。雄性SD大鼠,缺血1hr再灌7天,EA穴位为“水沟(GV 26)-内关(PC6)”。3.1 EA,sham-EA,MCAO,MCAO+Naltrindole 2 mM+EA,MCAO+Naltrindole 10 mM,MCAO+TAN-67 6 mM对大鼠脑梗死体积的影响雄性SD大鼠,缺血1hr再灌7天,应用Leica Q500图像处理系统,测定CV染色脑片的脑梗塞区域及损伤侧、对照侧半个脑片的面积,并计算脑梗死体积。结果显示:与缺血组相比,EA和6 mM TAN-67均可降低梗死体积,NAI 10 mM增加了脑梗死体积,而NAI 2 mM翻转EA的抗脑缺血作用,增加梗死体积。3.2 EA,sham-EA,MCAO,MCAO+Naltrindole 2 mM+EA,MCAO+Naltrindole 10 mM,MCAO+TAN-67 6 mM对BrdU免疫阳性细胞的影响MCAO+10 mM Naltrindole促进BrdU阳性细胞在缺血侧纹状体的表达,而EA和MCAO+TAN-67 6 mM降低BrdU阳性细胞的表达,MCAO+Sham EA、MCAO+Naltrindole 2 mM+EA和MCAO+aCSF组相比,BrdU免疫阳性细胞数目没有显著性差异。小结:1.多次EA“水沟、内关”具有明显的神经保护效应,多次给予DOR拮抗剂Naltrindole 2mM能够翻转多次EA对MCAO缺血/再灌大鼠的保护作用,提示在EA抗脑缺血损伤的保护作用中,DOR可能是一个重要的中间环节。2.脑缺血后BrdU阳性细胞数明显增多,EA及DOR激动剂TAN-67处理后,BrdU阳性细胞数有所减少,DOR拮抗剂则进一步增加了BrdU阳性细胞数。提示,脑缺血损伤后的神经发生很可能与脑损伤程度有关。综上所述,本工作获得以下结论:1.DOR拮抗剂Naltrindole加重脑缺血损伤,激动剂TAN-67具有明显的神经保护效应,提示DOR可能是抗脑缺血损伤的一个重要环节,同时CREB及BDNF表达的改变可能是DOR发挥神经保护作用的重要途径。2.EA的抗脑缺血损伤效应能被DOR拮抗剂Naltrindole翻转,提示DOR可能参与了EA的神经保护作用,CREB及BDNF表达的改变可能是DOR参与EA神经保护作用的重要环节。3.DOR激动剂TAN-67及EA均可减少脑缺血后BrdU阳性细胞数目,而DOR拮抗剂增加BrdU阳性细胞数目,提示大鼠脑缺血/再灌注损伤后的神经发生很可能与脑损伤程度有关。