【摘 要】
:
生物体通过一系列调节机制来应对时刻变化的内外环境。复杂生命系统中,尤其是高等动物中,高度特化的组织、器官、细胞类型甚至亚细胞器在响应环境变化时具有明确的分工。蛋白质作为生命活动的行使者,在各个调节通路中扮演着关键角色。因此,精准监测特定细胞类型中甚至亚细胞定位中蛋白质组的构成与动态变化对于了解细胞和生物体如何应对各类环境至关重要。本论文发展了一种基于正交翻译系统的动物新生蛋白质组标记技术,该技术能
论文部分内容阅读
生物体通过一系列调节机制来应对时刻变化的内外环境。复杂生命系统中,尤其是高等动物中,高度特化的组织、器官、细胞类型甚至亚细胞器在响应环境变化时具有明确的分工。蛋白质作为生命活动的行使者,在各个调节通路中扮演着关键角色。因此,精准监测特定细胞类型中甚至亚细胞定位中蛋白质组的构成与动态变化对于了解细胞和生物体如何应对各类环境至关重要。本论文发展了一种基于正交翻译系统的动物新生蛋白质组标记技术,该技术能够在活体动物中标记特定细胞类型中的新生蛋白质组。首先,我们通过“嵌合+突变”的策略获得了对非天然氨基酸Alk K具有更高识别效率的氨酰t RNA合成酶ch Pyl RS6;并将正交Pyl TCUA的反密码子突变为识别天然氨基酸赖氨酸(K)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和甲硫氨酸(M)的序列,K、A、S和M是生物体蛋白质中丰度较高的四种氨基酸且A和S在所有跨膜蛋白的氨基酸组成中占有较高比例,因此该设计使我们能够实现更高的蛋白质组覆盖率以及膜蛋白质组的标记。随后,我们利用CRISPR-Cas9技术获得了正交翻译系统SORTKASM的条件性表达转基因小鼠品系,然后将肝细胞特异性表达的TTR-Cre重组酶基因通过腺相关病毒(AAV)靶向递送到转基因小鼠体内,经饮水添加Alk K即可完成肝细胞新生蛋白质组的高效标记。接着,利用叠氮-炔烃的点击反应和生物素-链霉亲和素的富集策略,结合液相色谱-串联质谱分析,我们鉴定到一系列肝细胞代谢通路中的关键蛋白,其中相当一部分为参与物质转运、能量代谢和稳态维持等重要生理过程的膜蛋白。通过更换Cre重组酶的启动子,我们可以在任意细胞类型或组织中进行新生蛋白质组的标记。将SORTKASM技术与各种小鼠建模手段相结合,可以使我们研究小鼠在特定生理状态下不同细胞类型间蛋白质组的异同,或者某种特定细胞类型中蛋白质组的动态变化。总而言之,本论文开发的SORTKASM技术可高时空分辨率地标记、富集和分析活体动物中特定细胞类型的新生蛋白质组。凭借其在组织间甚至物种间良好的通用性,该方法在研究高等动物如何响应环境变化方面具有巨大的潜力。
其他文献
随着全球气候的变化以及人类活动对生态平衡的破坏,水资源短缺已经成为人类面临的重要环境问题,其中干旱是制约农业生产的重要因素,研究植物如何响应干旱、培育抗旱作物是解决这一问题的关键。类受体激酶(Receptor-like Protein Kinases,RLKs)是植物中最大的基因家族之一,近年来已有研究报道RLKs作为多种信号的受体在植物的生长发育、免疫应答以及非生物胁迫等方面发挥着重要的作用,但
植物对土壤养分的吸收除了植物自身的因素外,根际和根内的微生物种群对养分的活化、转运和吸收也起到关键作用。因此,根际和根内的微生物种群是描述植物生命活动的另一个维度,被认为是植物的第二基因组。禾本科作物水稻在缺铁条件下,通过向根际分泌麦根酸类物质——2’-脱氧麦根酸(Deoxymugineic acid,DMA),螯合土壤中被固定的三价铁(Fe3+),再通过Fe3+-DMA转运体将铁素转入水稻根内,
动态DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰,在叶片发育和衰老进程中发挥重要作用。DNA甲基化修饰的建立和维系主要受到DNA甲基转移酶的调控,然而关于DNA甲基转移酶在叶片发育和衰老过程中的功能和作用机制鲜有报道。番茄作为全世界重要的经济作物,阐明DNA甲基转移酶及其依赖的DNA甲基化修饰在番茄叶片发育和衰老中的表观遗传机制,将有助于丰富叶片衰老调控机制,并为推进表观遗传因子在延缓叶片衰老和番茄品质改良
球孢白僵菌(Beaueria bassiana)是一种昆虫病原真菌,广泛应用于多种害虫的生物防治。真菌细胞脂质代谢和脂滴稳态对菌体营养生长、发育分化和致病力等至关重要。本研究以球孢白僵菌为研究对象,通过遗传分析手段探究脂滴及脂质代谢相关基因的生物学功能。围脂滴蛋白Perilipin的功能解析Perilipin镶嵌在脂滴的磷脂膜上,对调控细胞脂质代谢有重要作用。Perilipin的生物学功能在动物细
气态乙烯在20世纪中期被正式确立为一种植物内源激素,其通过信号转导过程参与调控植物生长发育以及环境胁迫响应等一系列生物学过程,并与多种环境和激素信号存在庞杂的交互作用。现有的乙烯信号转导组分还不能很好地全面解析上述乙烯的功能和信号通路。因此,挖掘新的调控因子,并对它们进行鉴定和功能解析,是不断完善和拓展乙烯信号转导机制的重要途径。CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE 1(CTR
BTLA和HVEM是哺乳动物中一对特征明确的免疫检验点分子。然而,目前人们对它们在非哺乳动物物种中的功能仍知之甚少。论文的第一部分以大黄鱼为研究模型,鉴定了大黄鱼(Larimichthys crocea)的BTLA和HVEM分子(Lc BTLA和Lc HVEM)。Lc BTLA和Lc HVEM与哺乳动物的BTLA和HVEM同源分子具有相同的保守结构域,并且在不同的组织和细胞中的转录水平不尽相同,其
乳腺癌长期以来是人类健康重要疾病隐患,据2020年统计,全球新增病例约226万,其中68万人死于该疾患。中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的18.5%和17.2%,已居癌症死亡的第七位,是女性发病率最高的癌症,迫切需要持续开发新的诊疗策略和临床靶点。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)作为新近关注的研究热点,其在肿瘤发生、代谢进程及恶性转移中发挥重要调
铝毒害是酸性土壤上限制作物生产的主要因素之一。尽管以STOP1为核心转录因子的铝信号转导机制已研究得越来越深入,但植物如何感受铝离子并将信号传递给STOP1仍不清楚。类受体激酶(Receptor-like kinase,RLK)是一类定位于细胞膜,承担胞外信号感知和转导的膜蛋白,其可能在信号转导的上游发挥功能。但RLK通常功能冗余,为此我们实验室前期构建了一系列RLK过表达材料。通过铝敏感性筛选,
硫代硫酸盐是一种重要的无机含硫化合物,所含两个硫原子的化合价均位于硫的中间价态(0价和+4价),因此许多微生物能够以其为电子供体或电子受体来获取细胞生长所需的能量。奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)是一类兼性厌氧的革兰氏阴性菌,归属于γ-变形菌纲,因具有强大的呼吸多样性而受到广泛关注,是研究细菌呼吸的模式菌株。在无氧条件下,S.oneidensis能够还原硫代硫酸盐或单质
真核细胞的DNA持续经受着来自内外环境中的损伤威胁,导致DNA发生多重类型的损伤,而DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)是其中一种最严重的损伤类型。人们之前发现,细胞主要通过两种不同的途径—非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组(Homologous recombination,HR)对DSB进行修复。Ct IP(C