【摘 要】
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目的:溶酶体膜蛋白SIDT2的缺失在小鼠脂肪组织自噬和分化成熟过程中潜在机制初探。方法:本实验通过采用Cre/loxp重组酶系统构建全身Sidt2基因敲除的小鼠模型,利用腺病毒感染3
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目的:溶酶体膜蛋白SIDT2的缺失在小鼠脂肪组织自噬和分化成熟过程中潜在机制初探。方法:本实验通过采用Cre/loxp重组酶系统构建全身Sidt2基因敲除的小鼠模型,利用腺病毒感染3T3-L1前脂肪细胞获得Sidt2基因剔除的3T3-L1细胞模型。借助western blot检测小鼠脂肪组织和3T3-L1前脂肪细胞自噬通路关键蛋白表达情况。在发现Sidt2基因缺失小鼠脂肪组织和细胞均出现自噬途径受阻后,进一步使用影响自噬途径的药物氯喹、雷帕霉素、3-MA以及免疫荧光等实验方法更深一层探讨Sidt2基因在小鼠脂肪组织自噬途径中如何发挥作用。通过HE染色检测小鼠脂肪组织切片改变,油红O染色检测Sidt2基因剔除3T3-L1前脂肪细胞诱导分化变化情况,并继续从蛋白水平检测脂肪细胞诱导分化过程关键因子的表达变化情况。进一步探讨Sidt2、自噬和脂肪细胞分化三者之间的是否存在某种关系。结果:1.成功获得Sidt2基因剔除的小鼠模型和细胞模型并在基因和蛋白水平予以检测确定造模成功。2.蛋白水平检测自噬途径关键蛋白LC3B、P62等发现Sidt2基因剔除小鼠脂肪组织和3T3-L1细胞自噬通路受阻碍。3.用影响自噬途径药物处理3T3-L1细胞后检测其蛋白水平自噬关键蛋白改变确定Sidt2的缺失引起自噬溶酶体降解途径受阻。4.借助免疫荧光和mCherry-GFP-LC3B双标在共聚焦显微镜下更直接观察Sidt2基因缺失3T3-L1细胞自噬流改变。5.形态学脂肪组织HE染色观察Sidt2基因剔除小鼠脂肪细胞排列疏松,细胞边缘不清晰,脂肪细胞数量较正常组减少,脂滴体积代偿性增大。6.经油红O染色发现Sidt2基因剔除3T3-L1前脂肪细胞无法成功诱导成成熟脂肪结论:1.溶酶体膜蛋白SIDT2在小鼠脂肪组织缺失可导致自噬溶酶体降解途径受阻;2.溶酶体膜蛋白SIDT2在小鼠脂肪组织缺失可引起脂肪细胞分化成熟障碍;3.溶酶体膜蛋白SIDT2的缺失可引起自噬溶酶体降解途径受阻进而导致脂肪细胞分化成熟障碍。
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