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脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，可直接或间接引起机体发热、代谢改变、免疫功能紊乱，多器官功能损害、休克乃至死亡等许多病理生理过程。在哺乳动物中，Toll样受体4(TLR4)是介导LPS应答的模式识别受体，TLR4/CD14信号通路是介导LPS诱导炎性反应的重要通路。然而，鱼类中缺少MD2、CD14、TRAM等重要的信号分子，其TLR4是否识别LPS仍具有争议。本课题组前期研究发现，LPS可引起黄河鲤TLR家族中多种TLRs的表达响应，其中TLR4和TLR5最为显著。弄清黄河鲤有哪些LPS结合蛋白，以及这些蛋白的相互作用网络，是阐明鱼体对LPS应答机制的前提。为此，本研究采用亲和层析、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)、生物质谱(LC-MS/MS)等技术鉴定并验证黄河鲤血清中与细菌LPS具有相互作用的蛋白质，并初步研究介导LPS应答的蛋白复合物及蛋白相互作用网络，所获的主要结果如下：
1、LPS与黄河鲤血清相互作用蛋白的鉴定
采用亲和层析和生物质谱的技术，获得与LPS有相互作用的黄河鲤血清蛋白21个。在此基础上，通过Gentontology(GO)蛋白注释和KEGGPathway分析，发现2个信号传导通路相关蛋白甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)和Fetuin-A可能与LPS相互作用。
2、LPS与MBL和Fetuin-A的相互作用分析
为了进一步验证LPS与MBL和Fetuin-A之间的相互作用关系，我们采用基因克隆的方法获得黄河鲤MBL和Fetuin-A的全长序列。MBL的cDNA序列全长961bp，开放阅读框为738bp，编码245个氨基酸，5?非编码区136bp，3?非编码区87bp，预测蛋白相对分子量约为26.24kDa，理论等电点为6.11，其氨基酸序列包含1个信号肽和1个CRD结构域。CRD中含有四个保守的半胱氨酸残基(Cys150-Cys235、Cys222-Cys243)和与糖结合特异性相关的保守基序EPN-WND。克隆获得黄河鲤Fetuin-A的两个转录本，分别命名为Fetuin-AL和Fetuin-AS。Fetuin-AL序列全长1606bp，开放阅读框为1395bp，编码464个氨基酸，5?非编码区30bp，3?非编码区181bp；Fetuin-AS序列全长1114bp，开放阅读框为903bp，编码300个氨基酸，5?非编码区30bp，3?非编码区181bp，Fetuin-AL比Fetuin-AS增加一段由164个氨基酸组成的片段，含三个HRPGHGPP重复序列和四个AGRDPKDKTPDLRGHPEH重复序列。预测Fetuin-AL和Fetuin-AS蛋白相对分子量分别约为51.62kDa和33.48kDa，理论等电点分别为6.58和5.77。氨基酸序列均含有1个信号肽和2个CY(cystatin-like domain)结构域。
继而，通过原核表达、Ni-NTA柱分离纯化获得MBL重组蛋白(rMBL)和Fetuin-AS重组蛋白(rFetuin-AS)，将重组蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。在获得rMBL和多克隆抗体的基础上，通过ELISA检测发现rMBL以浓度依赖性的方式结合LPS；并且Westernblot结果显示，rMBL可以结合实验中的6种革兰氏阴性菌：(嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)；而且，在Ca2+存在的条件下，rMBL可以凝集上述6种致病菌。在获得rFetuin-AS和多克隆抗体的基础上，ELISA实验检测发现rFetuin-AS以浓度依赖性的方式结合LPS；并且Westernblot结果显示，rFetuin-AS也可以结合实验中的6种革兰氏阴性菌(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、和荧光假单胞菌、大肠杆菌)。这些结果表明进一步证实LPS确实可以与MBL和Fetuin-A相互作用，与亲和层析和质谱鉴定结果一致。
3、LPS对MBL/Fetuin-A/TLR4/TLR5的表达调控
首先，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同组织器官中MBL和Fetuin-A的表达。结果显示，MBL在不同组织器官中呈组成型表达，在肝脏中表达量最高，心脏、血液、肾脏、肌肉、脾脏、肠道、脑、皮肤和鳃中次之，头肾表达量最低。Fetuin-A在黄河鲤所有检测的组织中均有所表达，在肝脏中表达量最高，肌肉、血液、皮肤和心脏中次之，肾脏、头肾、脑、脾脏和肠道中表达量低，鳃中表达量最低。
进而，分别采用嗜水气单胞菌感染和LPS应激，检测黄河鲤肝、脾及头肾中MBL、Fetuin-A、TLR4及TLR5的表达变化，结果发现这些基因的表达水平均有不同程度的上调。
4、LPS应答的蛋白质相互作用网络
采用免疫共沉淀和生物质谱(LC-MS/MS)等技术，鉴定到与MBL有相互作用的蛋白30个，与Fetuin-AS有相互作用的蛋白18个，通过Gentontology(GO)蛋白注释和KEGGPathway分析，初步分析了LPS应答的蛋白质相互作用网络。
综上所述，本研究以黄河鲤为研究对象，筛选出了与细菌LPS有相互作用且可能参与LPS识别的分子MBL和Fetuin-A，并对其分子特征、组织分布、对细菌的表达响应及免疫功能进行系统研究。所获结果对揭示MBL和Fetuin-A在黄河鲤免疫防御中的地位具有重要意义，同时也为鱼类细菌性疾病的预防与控制提供了重要的科学依据。
1、LPS与黄河鲤血清相互作用蛋白的鉴定
采用亲和层析和生物质谱的技术，获得与LPS有相互作用的黄河鲤血清蛋白21个。在此基础上，通过Gentontology(GO)蛋白注释和KEGGPathway分析，发现2个信号传导通路相关蛋白甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)和Fetuin-A可能与LPS相互作用。
2、LPS与MBL和Fetuin-A的相互作用分析
为了进一步验证LPS与MBL和Fetuin-A之间的相互作用关系，我们采用基因克隆的方法获得黄河鲤MBL和Fetuin-A的全长序列。MBL的cDNA序列全长961bp，开放阅读框为738bp，编码245个氨基酸，5?非编码区136bp，3?非编码区87bp，预测蛋白相对分子量约为26.24kDa，理论等电点为6.11，其氨基酸序列包含1个信号肽和1个CRD结构域。CRD中含有四个保守的半胱氨酸残基(Cys150-Cys235、Cys222-Cys243)和与糖结合特异性相关的保守基序EPN-WND。克隆获得黄河鲤Fetuin-A的两个转录本，分别命名为Fetuin-AL和Fetuin-AS。Fetuin-AL序列全长1606bp，开放阅读框为1395bp，编码464个氨基酸，5?非编码区30bp，3?非编码区181bp；Fetuin-AS序列全长1114bp，开放阅读框为903bp，编码300个氨基酸，5?非编码区30bp，3?非编码区181bp，Fetuin-AL比Fetuin-AS增加一段由164个氨基酸组成的片段，含三个HRPGHGPP重复序列和四个AGRDPKDKTPDLRGHPEH重复序列。预测Fetuin-AL和Fetuin-AS蛋白相对分子量分别约为51.62kDa和33.48kDa，理论等电点分别为6.58和5.77。氨基酸序列均含有1个信号肽和2个CY(cystatin-like domain)结构域。
继而，通过原核表达、Ni-NTA柱分离纯化获得MBL重组蛋白(rMBL)和Fetuin-AS重组蛋白(rFetuin-AS)，将重组蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。在获得rMBL和多克隆抗体的基础上，通过ELISA检测发现rMBL以浓度依赖性的方式结合LPS；并且Westernblot结果显示，rMBL可以结合实验中的6种革兰氏阴性菌：(嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)；而且，在Ca2+存在的条件下，rMBL可以凝集上述6种致病菌。在获得rFetuin-AS和多克隆抗体的基础上，ELISA实验检测发现rFetuin-AS以浓度依赖性的方式结合LPS；并且Westernblot结果显示，rFetuin-AS也可以结合实验中的6种革兰氏阴性菌(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、和荧光假单胞菌、大肠杆菌)。这些结果表明进一步证实LPS确实可以与MBL和Fetuin-A相互作用，与亲和层析和质谱鉴定结果一致。
3、LPS对MBL/Fetuin-A/TLR4/TLR5的表达调控
首先，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同组织器官中MBL和Fetuin-A的表达。结果显示，MBL在不同组织器官中呈组成型表达，在肝脏中表达量最高，心脏、血液、肾脏、肌肉、脾脏、肠道、脑、皮肤和鳃中次之，头肾表达量最低。Fetuin-A在黄河鲤所有检测的组织中均有所表达，在肝脏中表达量最高，肌肉、血液、皮肤和心脏中次之，肾脏、头肾、脑、脾脏和肠道中表达量低，鳃中表达量最低。
进而，分别采用嗜水气单胞菌感染和LPS应激，检测黄河鲤肝、脾及头肾中MBL、Fetuin-A、TLR4及TLR5的表达变化，结果发现这些基因的表达水平均有不同程度的上调。
4、LPS应答的蛋白质相互作用网络
采用免疫共沉淀和生物质谱(LC-MS/MS)等技术，鉴定到与MBL有相互作用的蛋白30个，与Fetuin-AS有相互作用的蛋白18个，通过Gentontology(GO)蛋白注释和KEGGPathway分析，初步分析了LPS应答的蛋白质相互作用网络。
综上所述，本研究以黄河鲤为研究对象，筛选出了与细菌LPS有相互作用且可能参与LPS识别的分子MBL和Fetuin-A，并对其分子特征、组织分布、对细菌的表达响应及免疫功能进行系统研究。所获结果对揭示MBL和Fetuin-A在黄河鲤免疫防御中的地位具有重要意义，同时也为鱼类细菌性疾病的预防与控制提供了重要的科学依据。