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目的:异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cells transplantation, allo-HSCT)的卓越治疗效果与移植物抗肿瘤(graft versus tumour, GVT)效应有关。预防移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的措施如T细胞去除(TCD)和免疫抑制剂的应用,同时也会减弱GVT效应和有效植活。目前认为GVHD与GVT均为免疫反应,T细胞是主要效应细胞,二者相互联系,但在一定程度上可以分离。骨髓间充质干细胞(BMMSC)是骨髓中一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,由于有较低的免疫原性,对异基因活化的淋巴细胞具有增殖抑制作用,在异基因器官和细胞移植有广泛应用前景。MSC在异基因造血干细胞移植中作用机制的进一步研究已表明BMMSC能抑制aGVHD的发生,但对恶性血液病移植中GVT的影响尚无定论。本研究利用MHC半相合造血干细胞移植荷瘤动物模型,进一步探讨MSCs诱导免疫耐受的同时对移植物抗肿瘤(GVT)效应的影响。方法:1动物及细胞株1.1动物移植供鼠为清洁级C57BL/6H-2b(B6),8～12周龄;受鼠为清洁级CB6F1(BALB/cH-2d×C57BL/6F1, CB6F1H-2d×b),8～12周龄;MSC供鼠为清洁级B6,4～6周龄;以上动物雌雄兼用,由河北省实验动物中心提供。1.2 B16细胞株小鼠黑色素瘤细胞株(B16)购于河北医科大学实验动物学部,接种于CB6F1小鼠成瘤率达100%。10%FBS H-DMEM完全培养液,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,实验使用对数生长期细胞。2 MSC的制备将供B6小鼠脱颈椎处死后,常规无菌分离双侧股骨和胫骨,10%FBS F12/DMEM完全培养基冲出骨髓,轻轻吹打后以107/ml的密度种植于培养瓶中,72小时后行首次换液,此后每3-4天换液一次,当贴壁细胞层达到90%以上融合时,以0.25%胰酶加0.02%EDTA消化,行1:2传代,传至第3代以后的细胞,调整浓度待用。3荷瘤动物模型的建立将B16细胞接种于CB6F1小鼠左前腋下,待肿瘤长至约1×1×1cm3的时候无菌条件下取出肿瘤块,去掉中间的坏死组织后剪碎并研磨,PBS重悬后制得单个核细胞,台盘蓝拒染率>95%,调整浓度至备用。4半相合荷瘤移植模型的建立供受鼠均于移植前3天开始饮用酸化水;以CB6F1为受鼠,将研磨制得的B16细胞接种于受鼠左前腋下,24小时后接受60Coγ射线亚致死性全身照射(TBI)9.5Gy,剂量率为0.63Gy/min,预处理后2小时内尾静脉注射供鼠细胞,进行骨髓、脾淋巴细胞混合移植(骨髓MNC2.3×106+脾MNC7×106)/鼠,实验组同时输注不同剂量MSCs,并设立对照组。5移植分组a.同基因移植组:CB6F1→TBI+B16+CB6F1;b.无MSC移植组(GVHD组):B6→TBI+B16+CB6F1;c.低剂量MSC组:B6→TBI+B16+CB6F1 +MSC(5×103/鼠);d.中剂量MSC组:B6→TBI+B16+CB6F1 +MSC(5×104/鼠);e.高剂量MSC组:B6→TBI+B16+CB6F1 +MSC(5×105/鼠);f. TBI对照组;g.TBI+B16对照组;h. B16成瘤对照组;6 MSC对免疫细胞恢复的影响分别于移植前和移植后第21天时无菌采集各组存活小鼠眼眶血,分别注入肝素抗凝的无菌试管内,每份标本另取3只流式管,并于其内壁一侧分别加入5μl mCD4, 5μl mCD8,及10μl hCD56(Human, Cross-Reactivity*:Mouse),于流式管内壁的另一侧依次加入5μl mCD3,然后加入30μl已抗凝血并混匀,经固定离心后采用流式细胞术检测CD3+CD8+细胞和CD3+CD4+细胞和CD3-CD56+细胞含量,计算CD4+/CD8+比值。7观察内容自移植开始每天观察动物精神状态,GVHD发生情况、死亡时间,计算平均生存时间,绘制荷瘤组小鼠生存曲线;-1d～+60 d隔日在固定时间由尾静脉取血计数白细胞,称量动物体重,测量小鼠瘤块的大小并进行比较。8统计学分析数据计分析采用SPSS(13.0)统计软件包进行均数间比较,P<0.05认为有统计学意义。结果:1动物体重变化:各移植组体重均于+6d～+7d达到最低,且a、c、d、e组均较b组体重恢复快。f组体重于+10d～+11d达到最低后缓慢增长,并获得长期生存;g组于+19d～+20d达到最低水平,以后体重增长速度较快,但小鼠消瘦严重。2 WBC恢复情况:经过照射组动物的外周血白细胞均于+4d达最低水平。a、b、c、d、e、f、g组植入时间分别为9±2.1d、8.4±1.2d、6.2±1.7d、4.3±1.1d、5.8±2.3d、20±2.0d、20±1.51d。各MSC移植组造血重建时间明显早于自体移植组和无MSC移植组,并有统计学意义。f组和g组造血恢复最慢,与所有移植组比较均有统计学意义。3 GVHD发生情况:e组出现aGVHD的时间明显晚于b组(27±3.0d &10±2.3d,P<0.05),aGVHD发生率分别为60%(6/10)、100%(17/17),两组比较有统计学差异;使用MSC各组小鼠aGVHD表现较b组轻微,甚至无明显aGVHD表现。4 MSC对移植后肿瘤大小的影响:+30d时c组小鼠肿瘤为1.22±0.41cm3, h组为20.85±1.40cm3。h组与其它各组比较均有统计学意义;a组和g组与b、c、d、e各组比较有统计学意义,但a组和g组比较无统计学意义,提示同基因移植无抗肿瘤作用;使用MSC的c、d、e组+30d肿瘤大小虽随着MSC输注数值的增高,肿瘤有增大的趋势,但各组之间没有统计学差异,与无MSC的b组比较亦无统计学差异。实验中还发现aGVHD严重者,其瘤块较aGVHD轻者小鼠瘤块小。5生存时间观察:a、b、c、d、e组小鼠生存时间分别为58.71±3.29、54.41±7.62、59.63±1.06、59.44±1.67、58±4.0。f、g、h组小鼠生存时间明显缩短,与a、b、c、d、e组比较均有统计学差异(P<0.05)。b组小鼠生存时间与c、d、e组比较无显著性差异,但b组小鼠+50d天生存率明显低于c、d、e组。6 MSC对移植后免疫细胞恢复的影响移植+21d时CD3+细胞在同基因移植a组中表达明显低于半相合移植组。c、d、e组CD3+细胞伴随MSC的输注有降低趋势,但组间比较无统计学差异,提示MSC可减弱GVHD,并与剂量呈正相关,但本实验中无统计学意义。b、c、d、e组移植后CD8+细胞明显高于移植前,提示半相合移植伴随明显GVT效应;在MSC组中随MSC输注数量的提高,CD3+CD8+细胞有不同程度的降低,说明MSC可减弱GVT效应。a组CD4+/CD8+比值较其余各移植组恢复快,并有统计学差异,说明同基因移植机体免疫恢复迅速;移植后+21d时b、c、d、e组CD4+/CD8+比值仍较低,说明半相合移植免疫恢复缓慢。移植后b、c、d、e组CD4+/CD8+比值随MSC数量的提高有增高趋势,但组间比较没有统计学意义,提示MSC可以调节机体免疫状态。联合MSC移植的c、d、e组中随MSC输注数量的提高,CD3+CD4+细胞含量有增高的趋势,但组间比较无统计学意义(P<0.05)。各组小鼠移植后CD3-CD56+细胞含量,随MSC输注数量的提高有所升高,但无统计学意义,提示MSC对NK细胞影响较小。结论:1半相合移植组肿瘤明显小于自体移植组,提示半相合移植组具有GVT效应。2 MSC可以促进造血细胞植入,减轻aGVHD,延长受鼠生存期。3输注MSC可延迟aGVHD的发生,且与MSC剂量呈正相关;MSC可能减弱GVT作用,但本实验中无统计学意义。4 aGVHD重者,其瘤块明显小于aGVHD轻者,提示GVHD与GVT效应之间是相互联系的。5 BMMSC可以促进CD8+T细胞恢复,通过影响半相合移植后T细胞亚群恢复而影响GVHD和GVT的发生。6半相合移植组CD4+、CD8+、CD56+细胞及CD4+/CD8+恢复晚于自体移植组。