【摘 要】
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蚜虫是一种同翅目农林业主要害虫,繁殖力非常强,分布极广,给农作物和果树等经济植物造成严重的直接危害,并且能够传播多种植物病毒。目前防治蚜虫仍然以化学农药为主,但是容易造成
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蚜虫是一种同翅目农林业主要害虫,繁殖力非常强,分布极广,给农作物和果树等经济植物造成严重的直接危害,并且能够传播多种植物病毒。目前防治蚜虫仍然以化学农药为主,但是容易造成严重污染环境和农副产品,使蚜虫产生抗药性。随着人类对环保意识和生活品质的提高,更为安全、持久、高效的防治蚜虫的方法得到越来越多的关注。PCOO2基因是豌豆蚜虫唾液腺分泌的一种非常重要的蛋白基因,在蚜虫取食寄主植物过程中是必需的,PCOO2蛋白的N段含有一段分泌信号,在其他物种中没有任何同源蛋白。Navdeep S. Mutti等人在对豌豆蚜虫注射覆盖PCOO2基因大部分开放阅读框的siRNA,PCOO2的转录水平在注射后第三天显著下降,豌豆蚜虫在第三天死亡一半,PCOO2基因是豌豆蚜虫的必需基因。本研究通过GenBank找到豌豆蚜虫的基因序列,采用同源克隆法克隆到与豌豆蚜虫PCOO2基因同源的桃蚜的基因片段525bp,命名为APCOO2,构建沉默载体pBIN19::APCOO2i,通过植物转基因技术,培育能够产生靶基因siRNA的转基因番茄,利用转基因番茄植株饲喂桃蚜,观察蚜虫体内靶基因的表达情况,试图利用转基因植物介导RNAi,达到安全、持久、高效防治蚜虫的目的,在科学上具有很大的创新性,在农业生产上具有重要的实际应用价值。主要研究内容及结果如下:①桃蚜APCOO2基因的克隆以桃蚜总RNA为模板,体外反转录合成cDNA,以cDNA为模板,通过PCR扩增得到525bp大小的片段,将其命名为APCOO2,通过NCBI BLAST生物学信息分析,结果表明该片段的基因序列与豌豆蚜虫PCOO2有85%的相似度。②pBIN19::APCOO2i沉默载体的构建在桃蚜APCOO2基因片段两端分别引入酶切加位点(Hind III&Xba I)(Kpn I&Xho I),构建中间载体pHANNIBAL-APCOO2,然后将包含35S启动子、APCOO2基因、35S终止子的DNA片段剪切连接到表达载体pBIN19中构建成桃蚜APCOO2沉默载体。③转基因番茄植株的培育以番茄AC++子叶为外植体,通过农杆菌LBA4404介导侵染番茄子叶,将CaMV35S启动子调控下的pBIN19::APCOO2i表达载体转入番茄,经抗性培养基A3筛选诱导出愈伤组织,在诱芽培养基A4诱导出芽,经过50mg/L Kan及250mg/L的Carb筛选,获得一部分生根的再生植株。④桃蚜APCOO2表达水平提取桃蚜二龄和四龄期若虫RNA进行定量PCR检测APCOO2表达水平,二龄若虫APCOO2表达水平是四龄若虫表达量的两倍。
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