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肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)是引起家兔腹泻的主要病原菌,该菌具有高度传染性,严重制约了兔产业的健康发展。临床上常用抗生素进行防治,然而细菌耐药性问题的日益加剧致使养殖业发展和公共卫生安全面临严峻挑战。我国自2020年开始全面禁止在动物饲料中添加抗生素,该政策的落地实施成为保障动物源性食品安全和公共卫生发展的重要里程碑。因此,寻求新型抗生素替代品具有重要意义。噬菌体是一种能寄生在细菌上的病毒,利用其自身特异性侵染细菌,使被感染的细菌裂解死亡。噬菌体疗法是利用噬菌体进行抗菌治疗的一种方法,其只针对特定的细菌起作用,对正常菌群、人体和动物细胞并无影响,因此将其作为抗生素替代品具有潜在的应用前景。本研究对兔源大肠杆菌噬菌体进行了分离鉴定、生物学特性分析、基因组特征研究,以及评估其对兔大肠杆菌病的防治效果,旨在为利用噬菌体防控兔大肠杆菌病奠定基础。本研究对浙江省某兔场腹泻病兔进行病原分离鉴定,经革兰氏染色和PCR鉴定,分离出致病性大肠杆菌1株,命名为ZJE1株,ZJE1株对头孢类、四环素类等抗生素较敏感;以大肠杆菌分离株ZJE1为宿主菌,分离纯化出噬菌体5株,分别命名为ZRP1、ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5,并对噬菌体分离株的生物学特性进行了分析。用透射电镜观察噬菌体的形态与结构特征,发现噬菌体分离株由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成,5株噬菌体均属于肌尾噬菌体科。采用双层平板法测定了噬菌体分离株的宿主谱、最佳感染复数、p H稳定性、热稳定性和一步生长曲线,噬菌体ZRP1、ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5在p H5-7、55°C范围内保持良好活性,潜伏期为11-19分钟内,具有宿主特异性,在常规环境下具有较好的耐受能力。通过裂解活性测定5株噬菌体体外抗大肠杆菌ZJE1作用,发现5株噬菌体均能裂解ZJE1,ZRP5活性较高,滴度为3.68×1011PFU/m L。采用Illumina Hi Seq方法对5株噬菌体全基因组进行测序,结果显示5株噬菌体均为双链DNA的烈性噬菌体,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科,其中噬菌体ZRP1为Wifcevirus属,基因组长度68201bp,GC含量为46.16%;噬菌体ZRP2和ZRP3为Vequintavirus属,基因组长度分别为137511 bp、136351 bp,GC含量分别为43.61%、43.70%;噬菌体ZRP4和ZRP5为Tevenvirinae亚科、Krischvirus属,基因组长度分别为167091 bp、166580 bp,GC含量分别为40.40%、40.25%;5株噬菌体均为较新型噬菌体。进一步对ZRP4和ZRP5两株T4-like噬菌体进行比较基因组及功能分析,噬菌体ZRP4和噬菌体ZRP5基因组均由头部结构蛋白、DNA包装、尾管和尾鞘结构蛋白、基板结构蛋白、长尾纤维结构蛋白、裂解酶蛋白和调控酶蛋白模块组成。用噬菌体保守基因衣壳蛋白gp23基因构建遗传进化树,结果显示噬菌体ZRP4与KFS-EC属同一分支,噬菌体ZRP5与E26属同一分支,两株噬菌体基因仅有15个差异氨基酸;以T4噬菌体远端尾丝蛋白gp37构建进化树,结果显示噬菌体ZRP4与RB49属同一分支,噬菌体ZRP5与E26属同一分支,两株噬菌体基因C末端956-1215位氨基酸(260个氨基酸)序列差异较大。ZRP4和ZRP5两株共有基因249个,ZRP4特有基因23个,ZRP5特有基因18个。通过体外抑菌试验优选噬菌体ZRP1、ZRP2、ZRP3、ZRP4及ZRP5的等比组合物命名为ZRP1-5,用35日龄新西兰实验兔进行体内试验,评估噬菌体ZRP5与噬菌体组合物ZRP1-5抗ZJE1的作用效果。试验分组为A组(空白对照组)、B组(攻毒对照组)、C组(灌胃噬菌体ZRP5裂解液)与D组(灌胃噬菌体组合物ZRP1-5裂解液)。灌胃噬菌体或噬菌体组合物裂解液后,同时对B组、C组、D组分别经口灌胃50 m L浓度为4×108 CFU/m L的大肠杆菌ZJE1菌液。结果显示,B组(攻毒对照组)实验兔血液中白细胞、中性粒细胞数量和血清内毒素明显呈上升趋势,而C组和D组(噬菌体治疗组)实验兔血液中白细胞、中性粒细胞和血清中内毒素的含量显著低于B组(P<0.05)且实验兔的增重显著高于B组(P<0.05);回肠切片镜检结果显示,攻毒感染组实验兔肠上皮绒毛损伤明显,噬菌体治疗组实验兔的肠上皮则保持完整。结果表明噬菌体ZRP5和噬菌体组合物ZRP1-5在体内外均能杀灭兔源大肠杆菌,且噬菌体组合物ZRP1-5治疗效果优于噬菌体ZRP5。综上所述,本研究筛选出一种理想的兔大肠杆菌噬菌体组合物,并对其生物学特性和基因遗传学背景进行了探究,以期为临床开发抗兔源大肠杆菌感染的噬菌体组合物提供参考。