论文部分内容阅读
目的:黄芪品质以有豆腥气为佳。现代研究表明,豆腥气成分可作为信号分子,参与植物生长与次生代谢等过程。课题组前期研究表明,与豆腥气浓淡紧密相关的正己醛具有抑制黄芪幼苗生长、促进根多种活性成分积累的作用。本论文即在课题组已有研究的基础上,首先建立微量样品碱处理测定黄芪皂苷IV、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量方法,为微量样品如黄芪组织培养物、盆栽幼苗等材料中相关成分的定量分析提供一种简单可行的方法。其次,以平地移栽黄芪为材料,进一步研究正己醛处理对黄芪活性成分积累的影响。此外,我们对正己醛介导盆栽黄芪生长与次生代谢的分子机制进行了初步探索,并对萜类合成酶基因进行了挖掘和生物信息学分析。该研究对于进一步研究豆腥气成分在黄芪药材活性成分合成积累中的作用及其机制具有重要意义。方法:1.取0.15 g传统采收期黄芪根,按1:30的比例加入70%乙醇（内含不同浓度的氨水）,超声提取,以黄芪皂苷IV作为评价指标进行碱处理体系的优化。利用UPLC-QTRAP-MS多反应离子监测模式,采用BEH C18（2.1×50 mm,1.8μm,Waters）色谱柱,以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相,梯度洗脱。流速:0.2 mL·min-1,柱温:30℃,进样量:3μL,测定黄芪皂苷IV含量;2015版《中华人民共和国药典》第一部中黄芪含量测定项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱条件,HPLC法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量;UPLC-Q-TOF-MS法进行化合物的指认与表征。2.以2年生平地移栽黄芪为实验材料,采用单株根施方式,进行正己醛处理,剂量分别为5μL/株（实验组1）和10μL/株（实验组2）。每个处理20株,包括2个生物学重复,以具有相同扰动者作为空白对照。处理时间分别为:2016年6月29日、7月23日、9月13日上午9:00。2016年11月初采挖黄芪根,阴干后利用“1”方法进行含量测定。3.以50μM正己醛处理组和对照组盆栽蒙古黄芪幼苗为材料,利用二代测序技术构建蒙古黄芪转录组文库。通过对差异表达基因进行GO和pathway富集分析,并通过比对萜烯初生与次生物质特别是三萜皂苷合成酶基因表达,初步阐释正己醛介导蒙古黄芪生长与次生代谢作用机制。4.根据“3”转录组文库基因注释信息进行萜类合成酶（terpene synthase,TPS）基因初步查找、BLAST同源比对确认。采用MEGA4软件进行系统进化树分析,在线工具ORF finder、Compute pI/Mw、ProtComp 9.0进行生物信息学分析。以环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase,CAS）基因为例,以蒙古黄芪不定根为材料,我们初步分析了正己醛处理对其表达的影响。结果:1.含4%氨水的70%乙醇提取时,三质控指标成分收率最高,对应的检测线性范围分别为:10.7085.60μg·mL-1、1.03972.73μg·mL-1和1.05173.57μg·mL-1。该体系中,黄芪皂苷Ⅰ、酰基化毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷转化较完全,黄芪皂苷Ⅱ部分转化。2.与对照组相比,正己醛处理促进了黄芪药材中黄芪皂苷IV积累,但对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和多糖积累无显著影响。3.从构建的转录组文库中共获得82,619条Unigenes,核苷酸总长度为90,944,019 nt,总注释率达75.72%。5,791个差异表达基因中,其中2,518个基因注释至125条pathways,注释至“代谢途径”和“次生代谢物质合成”的数量最多。根据注释至“植物激素信号转导”途径中差异表达基因信息,绘制得信号转导途径,发现正己醛介导涉及到多条生长与防御信号途径。此外,除MVA途径三萜皂苷合成酶基因表达发生改变外,与叶绿素、赤霉素、脱落酸等合成有关的MEP途径酶基因表达亦发生改变。4.从黄芪转录组文库中共鉴定得76条TPSs,其中13条拥有完整的开放阅读框。其中,注释为TPS10基因数量最多,其次为大根香叶稀D合成酶（germacrene D synase）和单萜合成酶（Monoterpene synthase）。选取17条代表性TPSs进行氨基酸序列同源性分析,发现黄芪TPSs分为三个亚族,每一亚族均包括Ⅰ型和Ⅱ型萜类环化酶。共挖掘得3条CASs,亚细胞定位于内质网,在黄芪不定根中均有表达,且正己醛具有上调CAS2、CAS3基因表达的作用。结论:1.建立了一种碱处理微量样品测定黄芪皂苷IV、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量的方法,该方法显著提高了黄芪药材中三质控指标成分的收率。2.正己醛具有促进平地移栽黄芪药材黄芪皂苷IV积累的作用。3.多条生长与防御信号途径参与正己醛介导的信号转导过程,除三萜皂苷合成酶基因表达受到显著调控外,MEP途径合成的多种初生代谢萜烯类化合物合成酶基因表达也发生改变。4.鉴定得17条代表性TPSs,其中CASs定位于内质网膜,与三萜皂苷细胞质中MVA合成特征一致,正己醛具有上调CASs表达的作用。