脑血管疾病是目前人类疾病中仅次于心脏病和肿瘤的第三大死亡原因。其中缺血性脑血管病约占全部脑卒中的60%-80%。溶栓治疗是目前治疗缺血性脑卒中较为成功的方法。但是由于溶栓治疗时间窗狭窄和其严格的适应症及可能的严重副反应等限制,仅1%左右的脑卒中患者能够接受溶栓治疗,并且溶栓治疗的康复率只有30-35%。因此,广大的科研和临床工作者都在积极探索有效治疗缺血性脑血管病的方法。近十余年随着神经影像学和分子生物学技术的发展,缺血性脑损伤机制的研究已取得了巨大的进步。缺血诱导的细胞凋亡和细胞坏死,缺血后脑内的免疫应答、炎性反应和氧化应激等的相互作用在缺血性脑卒中的脑损伤过程中占有重要的地位。其中氧化应激被认为是疾病发生发展的一个中心环节。缺血性脑卒中理想的治疗要求针对其病理生理机制,且有较长的治疗时间窗,副作用少,方便实施。伴随干细胞技术和基础研究的发展,细胞治疗成为治疗神经系统疾病,特别是卒中的最有前景的治疗方法之一。干细胞移植治疗可以通过修复宿主神经通路,诱导神经重塑和新血管形成,分泌营养因子,召集内源性前体细胞等机制的共同作用促进神经功能恢复。并且可静脉输注,方便实施。治疗时间窗可为脑缺血后数小时到数周。近来脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)成为干细胞治疗的理想种子细胞,因其不但具有骨髓间充质干细胞的特点,并且干细胞更原始,端粒更长,活细胞数量更丰富,增殖能力更强,来源丰富,提取简单,不悖伦理,操作无创等一系列优势。但是目前基础和临床的干细胞移植研究结果却未能带给人们预期的结果。其中可能的因素是体内的局部病理环境限制了移植干细胞的存活和功能,如何提高移植细胞的存活和功能,成为目前人们关注的焦点和研究热点。干细胞移植治疗要取得理想的效果,还应根据患者的病理生理状况,制定相应的方案,使得进入体内的干细胞能够达到足够的数量,并能充分发挥其功能。针对缺血性脑血管病的病理生理机制的关键环节——氧化应激,减少其对间充质干细胞的损伤,无疑是提高干细胞疗效的一个可行方案。胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide1,GLP-1)是营养摄入后刺激肠道L细胞分泌的30个氨基酸残基的肽类激素,由胰高血糖素原基因表达形成的肠促胰岛素。GLP-1已经成为治疗2型糖尿病的新型药物,应用于临床治疗。GLP-1的基础研究显示GLP-1不仅对胰腺有重要的作用,可以促进放大葡萄糖依赖的p细胞胰岛素分泌,减少胰岛素p细胞的凋亡,增加其新生,减少胰高血糖素的分泌,减慢胃排空,增加饱感,增加外周葡萄糖的清理。而且GLP-1在中枢神经系统也具有重要的生理作用：GLP-1可以通过血脑屏障,促进神经轴突的生长和细胞存活,上调神经递质和酶的产生。GLP-1还被认为是一种生长因子,可促进有丝分裂,细胞生长,分化,并能打断凋亡前过程。GLP-1通过与GLP-1R的结合发挥上述众多的作用。有关研究还发现GLP-1可以防御氧化应激损伤,保护神经元抵御氧化应激损伤所导致的细胞死亡。GLP-1在脐静脉内皮细胞、神经细胞及心肌细胞等都可以发挥抗氧化损伤的作用,一项采用大鼠大脑中动脉梗死模型的研究发现,Exending-4预处理与对照组相比可减少梗死体积的50%,并可提高短期的神经功能。研究发现在骨髓间充质干细胞上有GLP-1受体表达,并且GLP-1可促进骨髓间充质干细胞的增殖,保护其维持未分化的作用,减少血清剥夺所诱导的骨髓间充质细胞的凋亡。关于GLP-1在脐带间充质干细胞中的表达和功能目前还尚未见报道,本课题旨在研究GLP-1是否可以协同增强脐带间充质干细胞治疗缺血性脑血管的作用,具体步骤是通过脐带间充质干细胞的分离培养,建立稳定的细胞培养体系,进一步研究：1脐带间充质干细胞上GLP-1受体的表达；2GLP-1对脐带间充质干细胞在氧化应激损伤条件下的保护作用及可能机制；3GLP-1在脐带间充质干细胞移植治疗缺血性卒中的可能机制,可否减少神经元凋亡,促进神经元新生和血管新生。各部分研究结果将简述如下：一、hUC-MSCs的分离培养和鉴定采用直接组织块法分离培养hUC-MSCs,通过形态学观察、细胞周期测定及流式细胞仪分析其表面标记(CD29, CD34, CD44, CD45, CD105,HLA-DR)和成骨、成脂肪诱导分化鉴定hUC-MSCs。结果显示,hUC-MSCs呈长梭形,贴壁生长,细胞周期分析绝大多数处于GO／G1期,表面标志检测CD34和CD45、HLA-DR为阴性,CD29,CD44、和CD105均为阳性。成骨和成脂诱导可以使hUC-MSCs出现钙盐沉积和脂滴,分化为成骨样细胞和脂肪样细胞,确定了所培养的细胞是高纯度的符合干细胞特征的hUC-MSCs。本部分实验建立了hUC-MSCs的稳定培养体系,为后续实验提供了稳定优质的细胞来源。二、hUC-MSCs的GLP-1受体鉴定GLP-1受体的表达是GLP-1发挥作用的结构基础。本实验以人脐带间充质干细胞为研究对象,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为阳性对照,人肝癌细胞株HepG2为阴性对照。通过RT-PCR方法鉴定人脐带间充质干细胞GLP-1受体的mRNA,用Western blot检测有无GLP-1受体表达。细胞免疫荧光实验以人肝癌细胞株HepG2为阴性对照,并进行DAPI和FITC细胞免疫荧光双染,用激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示,RT-PCR可以检测到GLP-1R mRNA表达,VVe stern blot可以检测到GLP-1R表达,但略弱于HUVEC。细胞免疫荧光结果显示为DAPI和FITC双阳性。上述结果从mRNA和蛋白水平验证了hUC-MSCs表达GLP-1R,为后续的体外实验奠定了结构基础。三、GLP-1对hUC-MSCs氧化应激损伤的保护作用及机制研究以正常培养基为对照组,以不同浓度过氧化氢(10μMol/L,20μMol/L,50μMol/L)作用hUC-MSCs2小时,以细胞活性、细胞凋亡率为检测指标,建立氧化应激损伤的细胞模型。进一步以不同浓度的GLP-1(10nmol/L20nmol/L30nmol/L)作用于氧化应激损伤细胞模型,筛选出GLP-1的最佳作用浓度。为探讨GLP-1的作用机制进行如下实验：正常对照组,氧化应激组,GLP-1处理组(20nmol/L), Exending9-39+GLP-1处理组,PI3K/Akt通路阻断剂LY294002+GLP-1处理组。分别选用流式细胞仪检测AnnexinV—FITC/PI细胞凋亡,CCK-8试剂盒检测细胞活性,观察各组的细胞凋亡和细胞活性。结果显示过氧化氢对脐带间充质细胞的细胞活性及凋亡的影响呈浓度依赖方式,以20μMol/L过氧化氢处理2小时为合适的细胞氧化应激损伤模型。20nmol/l为GLP-1对抗过氧化氢损伤的最佳作用浓度。GLP-1的保护作用在添加Exending9-39(GLP-1的拮抗剂),LY294002(PI3K/Akt通路阻断剂)后消失。实验结果提示：GLP-1对hUC-MSCs由过氧化氢诱导氧化损伤具有保护作用,是通过GLP-1与其受体结合,进一步通过PI3K/AKT细胞信号通路实现。四、GLP-1联合hUC-MSCs移植治疗大鼠脑缺血模型的作用及机制初步研究建立大鼠大脑中动脉梗塞模型,实验分为正常对照组,大鼠中动脉梗死组(MACO),GLP-1治疗组(缺血后给予腹腔注射90ng/100g), hUC-MSCs移植治疗组(缺血后48小时给予尾静脉注射hUC-MSCs1×106,1ml), hUC-MSCs+GLP-1联合治疗组(缺血后给予腹腔注射90ng/100g,缺血后48小时给予尾静脉注射UC-MSCl×106,1ml)。并按照时间分为1,3,7,14天四个亚组。分别在第7和第14天观察一般状况(体重,血糖),各亚组进行神经功能缺损评分后处死。正常对照组取脑海马部位免疫组化检测GLP-1受体。同时分别用免疫组化检测DCX观察新生神经元,检测CD31, a-SMA观察新生血管,c-fos检测缺血灶周围凋亡细胞。结果显示：模型组大鼠血糖与其他各组比较有升高,考虑为脑梗塞引起的应激有关。各组大鼠的体重比较无统计学意义。各治疗组大鼠神经功能均有改善,以联合治疗组显著。C-fos免疫组化结果显示GLP-1组神经元凋亡显著少于模型组,GLP-1治疗可以减少脑梗塞后的神经元凋亡。脐带间充质肝细胞移植组新生神经元DCX阳性细胞多于模型组和GLP-1治疗组,但联合治疗组最高。CD31和a-SMA免疫组化结果显示GLP-1治疗组的血管新生高于对照组,但低于干细胞移植组,以联合移植组最高。上述结果提示,GLP-1联合hUC-MSCs移植能够促进神经功能改善,可能机制为GLP-1能够减少梗塞周边区的神经元凋亡,促进了移植的hUC-MSCs的诱导神经发生和血管发生作用。1通过直接组织块法,成功分离、培养了hUC-MSCs,通过对该细胞生物学特性的观察及应用流式细胞检测其表面抗原,证实了所得到的贴壁细胞为hUC-MSCs。应用该方法可以获得具有多向分化潜能的高纯度hUC-MSCs,为后续实验提供了充足的hUC-MSCs来源和良好的实验基础。2从mRNA及蛋白水平上均显示人脐带间充质干细胞中存在GLP-1受体,此结果为后续的体外实验奠定了基础。3GLP-1对脐带间充质干细胞在体外的氧化应激损伤具有保护作用,其机制是GLP-1与其受体结合,进一步通过PI3K/Akt细胞信号通路实现。4GLP-1对大脑中动脉梗塞模型具有脑保护作用,可以减少梗塞周边的神经元凋亡5GLP-1联合脐带间充质干细胞移植能够显著促进大鼠大脑中动脉梗塞模型神经功能改善,可能机制为GLP-1促进移植的脐带间充质干细胞诱导神经发生和血管发生。本研究为脐带间充质干细胞移植治疗缺血性脑血管病获得更高疗效提供了新的思路。