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麦拓莱霉素是由藤黄灰链霉菌产生一种结构全新、抑菌效果明显的新型抗生素,具有很高的研究开发价值。寻找麦拓莱霉素的生物合成相关基因对确定该抗生素代谢途径、提高生产能力等具有重要意义。本实验室的前期研究表明麦拓莱霉素的生物合成可能涉及聚酮合成途径,本文试图通过同源克隆策略,根据已知大环内酯类抗生素的生物合成基因信息,采用PCR方法从藤黄灰链霉菌中克隆麦拓莱霉素的生物合成基因,并构建基因失活突变株,研究基因的功能。在对PCR循环参数优化的基础上,从藤黄灰链霉菌中依次克隆得到三个基因片段,总长度3659 bp,该基因簇命名为mai-PKS。对mai-PKS的序列分析表明,它包括4个基因,按照基因的排列次序分别命名为mai-MT、mai-KS1、mai-ACP和mai-KS2。Mai-MT基因长906 bp,编码301个氨基酸。Mai-KS1基因长1047bp,编码348个氨基酸。Mai-ACP基因长249 bp,编码82个氨基酸。Mai-KS2基因长1341 bp,编码447个氨基酸。Blast和Cluster分析显示,mai-MT基因的氨基酸序列与其他微生物的丙酰基ACP转移酶具有高度同源性,同源性为60%～80%。mai-KS1基因的氨基酸序列与其他微生物的3-氧酰基ACP合成酶具有高度同源性,同源性为65%～92%。mai-ACP基因的氨基酸序列与其他微生物的酰基载体蛋白具有高度同源性,同源性为68%～92%。mai-KS2基因的氨基酸序列与其他微生物的β-酮酰基合成酶的具有高度同源性,同源性为62%～90%。该基因簇中基因的排序与聚酮合成基因簇类似, 4个基因与阿维链霉菌具有最大同源性。利用mai-KS2基因,通过同源交换方法,构建了mai-KS2基因失活的阻断突变株。用液质连用技术检测次生代谢产物的合成,结果表明阻断突变株已不能合成麦拓莱霉素。基因mai-KS2乃至mai-PKS是与麦拓莱霉素生物合成相关的。本文首次从藤黄灰链霉菌中采用PCR扩增的方法克隆到与麦拓莱霉素生物合成相关的基因,确定了麦拓莱霉素的聚酮合成途径,为进一步研究该抗生素全生物合成基因和藤黄灰链霉菌的分子工程、新型杂合抗生素的组合生物合成奠定前期基础。