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肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种运动神经系统的退行性疾病,上、下运动神经元均受累,临床上主要表现为肌肉逐渐萎缩与无力,最后在3-5年内因呼吸衰竭而死亡。5-10%的ALS是家族性ALS(f ALS),90%ALS是散发性ALS(s ALS)。关于ALS的发病机制,目前尚未完全清楚,可能与超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变、氧化应激、免疫学机制、线粒体功能障碍、神经元周围胶质细胞的异常、氧化毒性等有关,而突变的SOD1基因被认为是引起f ALS最常见的基因,现已报道了多个SOD1突变位点,其中以G93A突变位点最多,而向小鼠体内转入人突变的SODl-G93A后,小鼠模型也因与人有类似的临床发病特点而成为世界上公认的研究ALS的动物模型。随着大量研究的进展,人们发现线粒体功能障碍在ALS发生发展过程中起着非常关键的作用,线粒体功能障碍有可能是ALS发病的始动因素,而与ALS发病密切相关的SOD1就在线粒体上定位存在。更有研究发现,在ALS患者以及动物模型的运动神经元细胞中的确存在着大量形态异常的线粒体和突变蛋白的蓄积。SOD1的主要功能是通过歧化反应将线粒体内的有毒物质(如ROS)氧化,从而达到解毒的目的。而SOD1基因发生基因突变时,SOD1与锌的结合力下降,从而导致了对运动神经元的毒性,而引起患者出现线粒体空泡化和膨胀。并且,SOD1突变的蛋白凝集物会阻碍线粒体的运输通道,抑制线粒体的生物学功能,从而造成线粒体损伤,同时激活细胞凋亡因子,造成运动神经元死亡而发生ALS。动力相关蛋白(dynamin related protein1,Drp1)与线粒体动态变化有密切联系,是介导线粒体分裂的因子,在正常状态下,细胞内的Drp1大部分位于细胞质基质中,大约只有3%结合在线粒体的外膜上。哺乳动物的线粒体进行分裂时,线粒体分裂蛋白1(Fis1)会促进Drp1聚集到线粒体的外膜上,以促使线粒体发生分裂,故Drp1表达增强可致线粒体持续分裂而引起细胞凋亡。PC12细胞为大鼠嗜铬细胞瘤细胞,该细胞富含合成及分解多巴胺所必须的酪氨酸羟化酶,单胺氧化酶等,其化学特性十分接近中脑多巴胺能神经元,同时具备瘤细胞特性,因此广泛用于中枢神经系统变性疾病的研究。番茄红素(lycopene)是一种类胡萝卜素,是存在于植物中的一种天然色素,主要存在于番茄、胡萝卜、西瓜和番石榴中,其中番茄的含量最高,目前它是自然界的植物中发现的最强抗氧化剂之一,具有很强的抗氧化作用和清除自由基的能力,具有预防心脏病、保护心血管、减缓动脉粥样硬化、预防多种癌症、抗老化、保护皮肤等多种生理功能。其在阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)等神经变性疾病中的保护作用已得到证实,但在ALS方面却未有报道。目的:本实验采用SOD1-G93A转染的PC12细胞制备ALS细胞模型,探讨番茄红素对转染所致的PC12细胞线粒体损伤的保护作用。方法:采用空(Empty,E)质粒、野生型(Wild Type,WT)质粒、SOD1-G93A质粒转染PC12细胞,显微镜下观察转染效率,选择转染效率达70%及以上的细胞孔,CCK-8检测细胞活力,并验证转染质粒后导致的细胞损伤。给予正常培养的细胞不同浓度的番茄红素(0、1、10、20、50、100μmol?L)处理,CCK-8检测细胞活力,观察药物对细胞的作用。使用SOD1-G93A质粒转染的PC12细胞,选择达转染效率的细胞孔,分别给予不同低浓度的番茄红素(0、0.1、0.5、1、5、10、20μmol?L)处理,CCK-8检测细胞活力,筛选番茄红素的最适药物浓度。将细胞分为正常细胞组,转染E质粒组(E),转染WT质粒组(WT),转染SOD1-G93A组(SOD1-G93A)。各组均分为空白对照组、番茄红素组,每组3个孔。番茄红素组使用含最适药物浓度的培养液培养细胞,对照组给予普通培养液培养。培养24小时后,mitotraker染色流式细胞仪检测ROS水平,激光共聚焦显微镜观察Drp1的变化,以观察番茄红素对SOD1-G93A转染的PC12细胞所致线粒体损伤的保护作用。结果:1转染E、WT、SOD1-G93A质粒后,显微镜下观察,选择转染效率达70%及以上的细胞孔,CCK-8检测细胞活力,E、WT、SOD1-G93A组与对照组比较,细胞活力逐渐下降,SOD1-G93A组细胞活力下降最明显,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。E组与WT组比较,差异无统计学意义,SOD1-G93A组与E、WT组比较,差异有统计学意义(P﹤0.05),说明造模成功。2 CCK-8检测结果显示给予正常细胞不同浓度的番茄红素后,20μmol?L、50μmol?L、100μmol?L组与对照组比较,细胞活力明显下降,差异有统计学意义(P﹤0.05),说明高浓度的番茄红素可对细胞生长、存活产生不利影响,不可用于细胞实验。给予转染SOD1-G93A的细胞低浓度的番茄红素后,与对照组比较,细胞活力逐渐升高,至药物浓度为10μmol?L时,细胞活力达最高,后又下降,因此筛选出可用于实验的最适药物浓度为10μmol?L。3转染WT质粒与转染E质粒的PC12细胞相比,细胞内ROS水平升高(P﹤0.05),转染SOD1-G93A的PC12细胞与转染E质粒、转染WT质粒的细胞相比,转染表达G93A的PC12细胞ROS水平明显升高(P﹤0.05)。转染SOD1-G93A的PC12细胞与转染E质粒、WT质粒的细胞相比,Drp1水平明显升高,说明转染表达G93A的PC12细胞存在线粒体损伤。4用最适药物浓度的番茄红素干预PC12细胞,E、WT、SOD1-G93A各组番茄红素组与对照组比较,ROS含量均明显降低(P﹤0.05),Drp1含量减少。结论:1成功制备了ALS的细胞模型,转染表达SOD1-G93A的PC12细胞存在线粒体损伤。2合适浓度的番茄红素可提高细胞活力,对G93A-SOD1转染的PC12细胞有保护作用。3番茄红素可协助清除ALS细胞模型内过量堆积的活性氧及降低Drp1的含量,这可能是番茄红素保护线粒体、减轻细胞损伤的可能机制之一。