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MicroRNA(miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的小分子单链RNA,它由一段具有发夹结构的单链RNA前体经Drosha酶和Dicer酶的剪切后生成。miRNA通过与目标mRNA分子的3端非编码区域(3-UTR)互补配对,使目标mRNA分子的翻译受到抑制或引起特异性的对mRNA分子的切割,从而在转录后水平对靶基因的表达进行调控。大量研究成果表明,miRNA参与着生物体中很多基本生命过程的调控,在生命活动中起着非常重要的作用。 miRNA研究领域迄今为止经历了三次突破:第一个阶段是发现miRNA的阶段,以及发现miRNA广泛参与调控细胞分化、增殖、凋亡、器官形成、个体发育等基本生命活动的阶段;第二个阶段是发现miRNA与肿瘤的发生发展相关,以及发现miRNA具有肿瘤标志物潜力的阶段;第三个阶段是发现血清、血浆及其他体液miRNA,以及发现这些体液来源的miRNA能非侵入地诊断肿瘤等疾病及判断预后的阶段。 对应于此miRNA的研究进展阶段,我们也进行了各个层面的研究。我们首先研究了miRNA在最基本的细胞分化和增殖的生命活动中扮演了什么角色。我们观测到解偶联蛋白UCP2(uncoupling protein2)的mRNA水平在小鼠心肌和骨骼肌中是高的,但是其蛋白水平却检测不到,我们发现这是由于一种肌肉特异性miRNA(miR-133a)抑制了UCP2蛋白在心肌和骨骼肌的表达造成的。并且,深入研究后我们又发现,UCP2在肌肉分化过程中起一个“车刹”的作用,而MyoD通过上调miR-133a抑制UCP2的“车刹”作用,使成肌分化进行下去。我们的这一发现精细描绘了一条包含MyoD、miRNA和解偶联蛋白在内的成肌分化调控通路,这不仅有助于阐明UCP家族受调控的分子机制,发现体内功能蛋白和microRNA之间相互作用的方式,同时该发现也有助于揭示心衰和肌肉萎缩等疾病的发病机理和分子内因,以及为这些疾病的治疗提供新的药物靶点。 对应于第二个研究阶段,我们探寻了miRNA在癌症的发生和发展过程中行使了什么功能。为了找出在发生结肠直肠癌时明显变化的miRNA,并揭示这些microRNA在肿瘤发生过程中起了什么作用,我们比对了miRNA在结肠直肠癌组织和切端正常组织的表达量,我们发现了许多miRNA发生了显著变化,并且这些miRNA可以起到肿瘤标志物的作用。同时,我们使用生物信息学预测了这些显著变化的miRNA可能作用的下游基因,并证实了KRAS原癌基因被miR-143调控。我们的实验结果显示miR-143在发生结肠直肠癌时的下调表达将释放其对KRAS的抑制作用,最终导致肿瘤的加速生成。综上,这项研究显示了microRNA在肿瘤诊断与治疗中的巨大应用价值,并且首次发现了miR-143的一项重要功能——通过抑制KRAS原癌基因行使肿瘤抑制因子的作用。鉴于结肠癌发病趋势的增高以及诊断的困难,该发现提供了一种新视角对该疾病进行诊断,并为结肠直肠癌的治疗提供了新的药物靶点。 对应于第三个研究阶段,我们采用单分子微阵列测序技术(Solexa)首次全面描绘了健康受试者和肺癌、结肠直肠癌、糖尿病患者的整个血清miRNA表达谱。我们发现人类血清内稳定存在一定水平的miRNA,而且在肺癌、结肠直肠癌、糖尿病等疾病状态下,血清miRNA的表达模式较正常状态将发生显著变化,并且特定的血清miRNA表达谱可以构成识别癌症与其他疾病的“指纹”,为癌症及其他疾病的检出提供一种新的非损伤性的诊断方法。该研究成果表明,血清miRNA可广泛用于癌症等疾病的普查工作,同时,该技术还可以改进单一的分子标记物所难以克服的低特异性和低灵敏度问题,因此能显著提高癌症等疾病的临床检出率,成为早期诊断的有效手段。并且,该技术还可用于肿瘤分类、预后及疗效预测、手术疗效监测及疾病复发预测等领域,并可能带来未来临床医学上的变革。 最后,虽然miRNA在个体发生学上的功能和作用渐渐被阐明,但是它在系统发生学、在进化上的意义还不是十分清楚。并且,一些重要的物种如文昌鱼中的miRNA还没有被发现。因此,我们使用Solexa测序技术和生物信息学鉴定了文昌鱼的miRNA表达谱。我们发现文昌鱼一共含有113个miRNA基因,其中55个是进化上保守的,58个是文昌鱼特异的。并且,我们使用生物芯片和qRT-PCR技术验证了我们的Solexa结果的可靠性。对文昌鱼所含的miRNA进行进化史定位,我们发现文昌鱼已经具有很多脊索动物和脊椎动物特有的miRNA。我们还发现文昌鱼从miRNA的进化位置的角度来说比海鞘更像哺乳动物。综上,我们的研究为解码脊椎动物的进化史提供了新视角,也提示了miRNA对于进化的巨大推动最用。 本文从单一miRNA的性质入手,研究了miR-133a在细胞分化和增殖中的作用,研究了miR-143在结肠癌的发生过程中的作用,同时,我们研究了一系列miRNA在发生疾病时的变化,并以此作为生物标志探讨了其在临床诊断方面的应用,最后,我们鉴定了文昌鱼的全部miRNA,再对其进化史进行定位,找到了miRNA在进化史上的一个规律——miRNA与生物复杂性相关。总之,我们通过方方面面的研究方法,将miRNA这一整体放在个体上、整体上、进化史上观察规律,发现miRNA不仅与发育、增殖等重要的生理功能相关,也有重大的临床应用价值,同时对进化也有指导作用。