翻译后修饰极大地丰富了细胞内蛋白质的功能多样性,对细胞正常生长和正确执行功能至关重要。泛素化作为翻译后修饰中较为独特的一种,包含单泛素与多种泛素链同底物的可逆共价连接。泛素是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白,在一系列酶的催化下,它羧基端的甘氨酸与底物赖氨酸侧链的氨基通过异肽键共价连接。泛素化过程通常需要泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3这3种酶的级联作用。目前已知人类基因组编码有两个E1,约40个E2,约700个E3,以及约100个去泛素化酶DUB。类泛素蛋白可分为泛素结构域蛋白（含有可作为蛋白与蛋白相互作用结构域的泛素样结构域,但无法连接到底物上）和泛素样修饰物（可以通过E1-E2-E3的级联反应连接到底物上）。ISG15是第一个被鉴定的类泛素蛋白,与大多数组成型表达的类泛素蛋白不同,ISG15以及启动ISG15共价连接的激活酶Uba7的表达受干扰素的诱导,表明ISG15的修饰受到严格的调控。ISG15既能通过一系列酶的级联作用与靶蛋白共价结合,也能以游离形式存在而发挥功能。泛素存在于所有真核生物中,ISG15仅存在于脊椎动物中,ISG15氨基酸序列的跨物种保守性较低,说明它对于细胞的基本功能很可能是非必需的。自1981年发现泛素以来,Uba1长期被认定为唯一的泛素激活酶,后来的研究发现类泛素激活酶Uba6也能激活泛素,这使得Uba6成为了两个不同的激活酶激活同一个类泛素分子的唯一案例。另外,共享激活酶的例子包括Sae1-Uba2可以激活SUMO1、SUMO2和SUMO3,Atg7可以激活ATG8和ATG12,以及Uba6可以激活泛素和FAT10。这些现象表明,旧有的一个激活酶匹配一个类泛素分子的观点不再有效。令人意外的是,Uba6作为第二个泛素激活酶,它和Uba1的亲缘关系却相距甚远（氨基酸序列的同源性只有约40%）,但是Uba7与Uba1在系统发育关系上却更为接近。目前Uba7仅作为ISG15唯一的激活酶而被认识和存在。合作的实验室意外发现注射斑马鱼uba7 m RNA能部分挽救uba1缺失突变体的表型损伤,同时氨基酸序列比对显示,斑马鱼的Uba7与Uba1（zUba7与zUba1）约有58%的相似性,这些线索暗示zUba7很可能激活泛素通路。体外泛素化实验结果显示:重组表达的zUba7蛋白能激活泛素和z ISG15,但不能激活SUMO或NEDD8,表明zUba7蛋白具有泛素激活酶活性。那么由zUba7激活的泛素能转移到E2上吗?通过用20个重组表达的斑马鱼的E2进行泛素转移实验,发现zUba7激活的泛素只能转移到z E2D1,z E2D2,z E2D3,z E2G1,z E2G2,z E2L3和z E2S这7个E2上,另外13个完全不能或只能以极低的效率被转移,表明zUba7能将泛素转移至部分E2。体外自泛素化和底物泛素化实验显示,zUba7能够启动z Smurf1与z Mdm2的自泛素化修饰以及z Mdm2对斑马鱼P53（z P53）的泛素化修饰,因此zUba7在体外能够激活泛素化修饰通路。斑马鱼uba1缺失突变体中,泛素水平较野生型明显低降;将斑马鱼uba7的m RNA回补注射到uba1-/-突变体胚胎中,可以挽救因uba1缺失造成的泛素化水平的降低,因此zUba7能够在斑马鱼体内激活泛素化通路。这些结果表面斑马鱼的zUba7可以作为泛素激活酶发挥作用。UBA7基因只存在于脊椎动物中,而其它（类）泛素化的E1激活酶从酵母到人类几乎都存在。Uba1蛋白包含六个结构域:非活性腺苷化结构域IAD、活性腺苷化结构域AAD、第一催化半胱氨酸结构域FCCH、第二催化半胱氨酸结构域SCCH、四螺旋束4HB和羧基端泛素折叠结构域UFD。泛素分子主要同FCCH与AAD结构域相互作用。结构域分析表明,Uba7、Uba6与Uba1具有相似的结构,暗示UBA7、UBA6和UBA1可能起源于同一个基因。将部分代表性脊椎动物Uba6、Uba7与文昌鱼Uba1的氨基酸序列进行比对发现,来自姥鲨、斑点雀鳝、斑马鱼和腔棘鱼的Uba7与Uba1有60%的序列相似性,相同物种的Uba6与Uba1只有40%的序列相似性。另外,Uba7蛋白的FCCH与AAD结构域同文昌鱼Uba1相应结构域的保守性很高,而Uba6蛋白的FCCH与AAD同Uba1相应结构域的保守性要低得多。利用Uba1、Uba6和Uba7的氨基酸序列构建系统发育树,发现祖先UBA1基因经过两次复制事件,演化为UBA6和UBA7,UBA6首先从UBA1/UBA7分离出来,然后是UBA1和UBA7的分离。与此一致,在部分代表性脊椎动物中,UBA7基因的外显子-内含子结构与UBA1相似,而且通过基因座共线性分析,发现UBA7和UBA1基因座之间含有旁系同源的基因集,反映了物种内UBA7和UBA1所在染色体古老的亲缘关系。这些证据表明脊椎动物中的UBA7极有可能起源于UBA1基因的复制。斑马鱼的zUba7能激活泛素,也能激活斑马鱼的z ISG15,而人的h Uba7只能激活人的h ISG15。为了研究其他脊椎动物的Uba7是否也能激活泛素,我们在大肠杆菌和HEK293T细胞中重组表达纯化了姥鲨、斑点雀鳝、腔棘鱼、安乐蜥、原鸡、鸭嘴兽和负鼠的Uba7蛋白,通过体外泛素化实验检测它们激活泛素的能力,结果显示只有鱼类的Uba7可以激活泛素。这些结果表明,鱼类的Uba7蛋白依然保留有祖先Uba1蛋白激活泛素的能力,随着物种的演化,这种能力在其他物种中丢失殆尽。与此同时,Uba7蛋白的序列以及结构渐渐发生着改变,最终演化为ISG15特异的E1。当我们将zUba7与h Uba7的羧基端互换后,zUba7不再能激活泛素,而h Uba7获得激活泛素的能力。而无论是将位于羧基端的AAD1还是AAD2结构域进行互换,zUba7激活泛素的能力都将丢失,表明,AAD1与AAD2对于zUba7激活泛素都是必须的。为寻找导致zUba7和h Uba7活性差异的关键位点,我们通过Robetta对zUba1、zUba7和h Uba7的结构进行预测,并对所有可能的相互作用位点进行分析,发现其中三个位点对于zUba7能激活泛素是必须的。在鱼类中Uba7也显示出两种范例,第一个范例是一个E1可以激活两种类泛素蛋白:泛素和ISG15。为理解Uba7对底物的偏好性,我们对zUba7激活泛素和z ISG15的速率进行了比较,发现zUba7激活泛素的速率低于激活z ISG15的。进一步进行竞争性分析,发现当泛素与z ISG51同时存在时,zUba7将优先激活z ISG15。第二个范例是泛素能被不同的E1激活。为理解zUba1和zUba7激活泛素的差异,我们对两者激活泛素的速率进行了比较,发现zUba7和zUba1激活泛素的效率相似。进一步进行竞争性分析,发现当有足够泛素存在的情况下,等摩尔量的zUba1与zUba7激活泛素的量相当。以上结果表明,zUba7具有与zUba1相当的激活泛素的能力,但如果有z ISG15的存在,更倾向优先激活z ISG15。综上所述,本研究发现:在斑马鱼中,Uba7可以作为第三个泛素激活酶发挥作用;系统发育分析表明,UBA7起源于UBA1的复制,Uba7蛋白在鱼类中依然保留有祖先蛋白激活泛素的能力,而这一能力在四足动物中丢失;鉴定了Uba7激活泛素所必须的结构域以及关键氨基酸位点;另外Uba7激活ISG15的能力可能来源于祖先蛋白Uba1微弱激活ISG15的副功能。根据这些发现,我们提出UBA7起源与演化的模型:在520-550百万年前的第二次全基因组复制事件期间,原始基因UBA1复制产生了一个旁系同源基因UBA7,在鱼类中的Uba7依然保留有原始蛋白Uba1的激活泛素的特性,环境的变化使其原本较弱的激活ISG15的性质变得有利,Uba7积累了突变,允许与新的底物（ISG15）特异性结合,并且在四足动物中丢失了激活泛素的能力,逐渐演化为ISG15特异的E1。本研究在分子水平上显示了蛋白质-蛋白质之间如何通过演化产生新的相互作用,也显示了一个蛋白酶如何通过随机突变和自然选择而从主要活性之外微弱的次要活性演变出新的特异性活性。