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目的:肠道黏膜屏障损伤是炎症后肠易激综合征(PI-IBS)内脏痛敏的关键原因,其具体发生机制尚不明确,也缺乏特异性的治疗方法。我们前期研究发现冬凌草甲素(Oridonin,ORI)可以改善PI-IBS大鼠肠道黏膜屏障损伤并减轻内脏痛敏,其具体分子机制有待深入研究。近期研究显示PXR/NF-κB负反馈环可调节肠道黏膜屏障功能,但冬凌草甲素是否通过该环路调控肠道屏障功能减轻内脏痛敏尚不明确。本项目拟采用PI-IBS大鼠模型,考察冬凌草甲素减轻PI-IBS内脏痛敏的疗效;以PXR激动/拮抗PI-IBS大鼠模型结合肠道屏障功能评价指标,探究冬凌草甲素通过激动PXR改善肠道粘膜屏障功能的作用;在过表达/沉默PXR的细胞中,利用分子生物学手段,明确冬凌草甲素通过PXR/NF-κB负反馈环调节Caco-2细胞屏障功能的分子机制,研究结果对明确冬凌草甲素治疗PI-IBS的分子机制以及进一步认识PI-IBS的发病机制具有重要意义。方法:采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)制备PI-IBS大鼠模型,以病变活动指数(DAI),腹部收缩反射实验(AWR),结肠长度及结肠组织病理学变化为指标,明确ORI对PI-IBS的治疗作用;采用LC-MS/MS法检测乳果糖/甘露醇(L/M)的比值变化,从基因和蛋白水平测定PI-IBS大鼠和Caco-2细胞肠道紧密连接蛋白水平,分析ORI对PI-IBS肠道屏障功能的保护作用;再从体内和体外考察ORI作用后PI-IBS大鼠和Caco-2细胞中PXR/NF-κB信号通路及其下游相关因子的变化,评估ORI调控肠道粘膜屏障功能的作用机制;最后构建PXR激动/拮抗大鼠和细胞模型,探究ORI对PXR潜在的激动作用。结果1.ORI药效学评价:TNBS造模成功后,PI-IBS组大鼠DAI指数显著升高,内脏痛阈值降低,肉眼可见结肠水肿萎缩,组织病理学评分升高,表明模型制备成功,给予ORI治疗14天后上述情况均得到不同程度缓解,表明ORI对大鼠有治疗作用。2.ORI对PI-IBS肠道屏障干预作用:TNBS结肠灌注4 w后,PI-IBS组大鼠尿液L/M显著升高,结肠组织紧密连接蛋白Occludin、Claudin 1和ZO-1水平降低,显示PI-IBS组大鼠肠道屏障功能受损;用ORI干预后,大鼠尿液L/M水平降低,且紧密连接蛋白均有不同程度的升高;在体外构建Caco-2细胞屏障损伤模型,ORI干预后亦可显著增加紧密连接蛋白的表达。提示ORI可以改善PI-IBS大鼠及Caco-2细胞受损肠道屏障功能。3.ORI通过PXR/NF-κB信号通路改善肠道屏障损伤的作用:TNBS造模成功后,PI-IBS大鼠结肠组织PXR基因和蛋白表达水平降低,而NF-κB信号通路有关的p-P65/NF-κB蛋白表达水平升高,当给予ORI干预后,上述因子表达水平均逆转;此外,PI-IBS大鼠结肠组织PXR下游CYP3A4和P-g P靶基因和蛋白水平均降低,而NF-κB信号通路下游靶基因NF-κB、i NOS、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著升高,当给予ORI干预后,上述因子表达水平均逆转;在体外构建Caco-2细胞屏障损伤模型中,ORI也可显著逆转与PXR/NF-κB信号通路有关的因子表达,与动物实验一致,提示ORI可通过调控PXR/NF-κB信号通路改善PI-IBS。4.ORI对PXR的激动作用:ORI和PXR分子对接显示,ORI可作为PXR的底物发挥作用。与正常对照组大鼠相比,给予ORI后结肠组织PXR基因和蛋白表达水平显著升高,与经典激动剂作用类似;体外结果表明,ORI不仅可以升高正常Caco-2细胞PXR的表达,当用PXR抑制剂干预后,也可以激动PXR的表达,提示ORI可作为PXR的底物,且对PXR有潜在的激动作用,表明ORI通过激动PXR,调控PXR/NF-κB信号通路,从而改善肠道屏障损伤。结论:本实验结果表明ORI通过增加PI-IBS大鼠和LPS诱导的caco-2细胞中紧密连接蛋白的表达并修复肠道屏障损伤,对PI-IBS大鼠产生治疗作用,其分子机制可能与ORI对PXR/NF-κB信号通路的调节作用有关。ORI作为PXR配体,可用于PI-IBS治疗药物的开发。