论文部分内容阅读
目的：先前有研究表明环氧化酶-2(Cyclooxygenase 2, COX-2)是软骨细胞分化和骨组织修复过程中起重要作用的关键分子,基于此我们假设在下腰痛(Low back pain, LBP)的发病过程中COX-2功能缺失将延缓椎体终板(Vertebral endplates,VEP)的骨化以及椎间盘(Intervertebral discs, IVD)的退变进程。本实验中我们努力探讨COX-2的作用机制,以及其与成骨相关蛋白如Bone morphogenet i c protein 2(BMP-2)、Hedgehog (Hh)的相互关系。最后,我们探讨了非甾体类消炎药(NSAIDs),特别是COX-2选择性抑制剂在退变性椎间盘疾病中的临床应用。方法：通过X光线和组织学方法评估5月龄COX-2野生型小鼠(COX-2 WT)和COX-2基因敲除型小鼠(COX-2-/-)的腰椎退变情况。分离和培养SD大鼠的髓核(Nucleus pulposus, NP)细胞,使用不同浓度的Prostaglandin E2(PGE-2)刺激髓核细胞,Real-Time PCR(RT-PCR)检测Transforming growth fact-β (TGF-β)超家族、Vascular endothelial growth factor(VEGF)、炎性细胞因子Interleukin-1(IL-1)、Tumor necrosis factor-α (TNF-α)、软骨基质蛋白Collagen2(Col2)、 Aggrecan,基质降解蛋白酶a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5(ADMATS5)、 Matrix metalloproteinase 13(MMP13)以及Hedgehog家族蛋白的蛋白表达。分离和培养小鼠腰椎间盘终板软骨细胞,加入重组小鼠Shh蛋白刺激,通过RT-PCR和Western Blotting检测BMP信号通路相关蛋白的表达。人类终板软骨细胞培养,加Celecoxib刺激。建立小鼠椎间盘体外培养模型,加COX-2选择性抑制剂Celecoxib刺激。用免疫组化的方法研究COX-2 WT和COX-2-/-小鼠腰椎间盘组织、手术过程中收集的腰椎退变患者椎间盘终板软骨以及体外培养的椎间盘组织,检测COX-2, Shh, Noggin, pSmadl等蛋白表达。结果：X光线和组织学方法的评估结果表明：5月龄COX-2-/-小鼠腰椎间盘终板软骨骨化程度较COX-2 WT小鼠明显减轻。确定上述表型变化是否由于COX-2功能缺失导致椎间盘细胞中PGE-2活性降低引起,大鼠髓核细胞加入不同浓度PEG-2刺激,RT-PCR结果表明PGE-2浓度降低能上调Shh的表达。探索Shh是否能够通过旁分泌途径和邻近椎体终板软骨细胞中BMP信号通路相作用,小鼠椎体终板软骨细胞中加入重组小鼠Shh蛋白刺激,结果表明Shh能上调椎体终板软骨中Noggin的表达。免疫组化结果显示：COX-2-/-小鼠较COX-2 WT小鼠椎间盘终板软骨Noggin表达升高,而Smadl的磷酸化水平降低。腰椎退变患者椎间盘终板软骨标本显示Modic改变组COX-2的表达和Smadl磷酸化水平较无Modic改变组升高；而无Modic改变组Shh和Noggin的表达要高于Modic改变组。体外培养的小鼠椎间盘和人类终板软骨细胞加Celecoxib刺激后降低了COX-2的活性,促进Shh、Noggin的表达,降低了Smad1的磷酸化水平,从而抑制了BMP-Smadl信号通路。结论：COX-2/PGE-2通过Noggin/BMP信号通路的在椎间盘终板软骨骨化和椎间盘退变过程中发挥着重要作用。这一系列实验结果表明,临床工作中可以使用COX-2抑制剂来缓解下腰痛患者的腰椎退变程度。