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背景:研究已证明饮用水消毒能减少全球大多数国家的介水传染病的传播。但饮用水消毒同时会产生有害的消毒副产物(DBPs)。流行病学研究发现,饮用氯化水与罹患膀胱癌的风险增加之间存在潜在关联,但由于多年来 DBPs与不良生殖作用的相关性的趋势并不一致,导致目前对 DBPs的毒性作用仍然存在争议。世界卫生组织(WHO),欧洲环境局(EAA),美国环境保护局(USEPA)和中国已对部分已知的 DBPs制定了饮用水水质标准,这些DBPs包括总三卤甲烷(TTHM)和五种卤乙酸(HAA5)。
尽管已有部分关于氯乙酸(CAA)和2,6-二氯-1,4-苯醌(2,6-DCBQ)的神经发育毒性的相关研究报告,但对于 DBPs的神经毒性,我们的了解依然较少。CAA是一种有机酸,广泛存在于饮用水配水系统中,含量约为2-82μg/L。美国和欧盟国家已将CAA在水中浓度限定为0.07 mg/L。目前有研究报告 CAA能够影响培养的神经细胞的发育。同时,研究报道2,6-DCBQ作为新型的卤代苯醌(HBQs)类 DBP,在氯化饮用水中不断被发现,浓度范围常为4.5-274.5 ng/L。2,6-DCBQ能够影响人神经干细胞的分化并引起 S期细胞周期停滞,但是 CAA和2,6-DCBQ类消毒副产物尚未在中国和世界其他地区受到专门监测和管理。
目的:研究 CAA和2,6-DCBQ对未分化和分化的神经元 SH-SY5Y细胞的毒性作用。因目前中国尚未制定相关的标准进行监管,但二者在饮用水中的被频繁检测出来,结合最近报告的关于二者的神经发育毒性,本研究选择 CAA和2,6-DCBQ作为主要研究对象。
方法:本研究方法分为两部分,第一部分为对未分化的 SH-SY5Y细胞进行的实验。将未分化的 SH-SY5Y细胞在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、1 mg/mL链霉素的 DMEM中培养,采用 MTT测定法间接检测暴露于 CAA或2,6-DCBQ24、48和72小时后未分化的神经元 SH-SY5Y细胞的活力和增殖。采用光学显微镜观察暴露于 CAA或2,6-DCBQ72小时后未分化神经元 SH-SY5Y细胞的形态变化。最后,采用流式细胞仪对未分化的细胞进行细胞周期时象分析,以评估 CAA和2,6-DCBQ对未分化细胞的细胞周期的影响。
第二部分为对神经分化的SH-SY5Y细胞进行的实验。SH-SY5Y细胞的神经分化通过将细胞暴露于10μmol/L的维甲酸(RA)中诱导48小时。MTT测定法间接检测暴露于CAA或2,6-DCBQ24、48和72小时后,分化的 SH-SY5Y细胞的活力和增殖。将细胞暴露于CAA或2,6-DCBQ下48小时后,进行光学显微镜和免疫荧光显微镜观察,并检测分化的 SH-SY5Y神经元细胞的β-微管蛋白(β-tubulin)的表达、神经生长及细胞形态。最后,采用流式细胞仪对分化的细胞进行细胞周期时象分析,以确定 CAA和2,6-DCBQ对分化细胞的细胞周期的影响。
结果:第一部分结果包括 CAA和2,6-DCBQ对未分化的 SH-SY5Y细胞形态、活力、增殖和细胞周期的影响。通过MTT测定暴露24、48和72小时后未分化的SH-SY5Y细胞,获得细胞生长曲线、剂量-反应关系和半数抑制浓度(IC50);CAA在24、48和72小时的IC50分别为1066±80、639±34和610±61μmol/L,而2,6-DCBQ为41±6、33±4和35±6μmol/L。未分化的 SH-SY5Y细胞暴露于相同等效生物浓度的 CAA(IC50的1/2和1/4:533和266μmol/L)和2,6-DCBQ(IC50的1/2和1/4:20和10μmol/L)会严重影响未分化的 SH-SY5Y细胞形态、细胞活力和增殖。细胞周期分析结果表明,暴露于相同等效生物浓度的 CAA(IC50的1/2和3/4:533和800μmol/L)和2,6-DCBQ(IC50的1/2和3/4:20和30μmol/L)后,2,6-DCBQ引起了未分化细胞的 S期细胞周期阻滞现象(P<0.05),而 CAA未引起细胞周期的改变,因此,在未分化的 SH-SY-5Y细胞中,相比CAA,2,6-DCBQ具有更大的细胞毒性。
本研究第二部分的结果为CAA和2,6-DCBQ对神经分化的SH-SY5Y细胞形态、活力、增殖、β-tubulin的表达和细胞周期的影响。通过 MTT测定暴露24、48和72小时后的分化的神经细胞,获得细胞生长曲线、剂量-反应关系和半数抑制浓度(IC50);CAA在24、48和72小时的IC50分别为718±74、679±71和514±61μmol/L,而2,6-DCBQ为35±0.4、29±1和27±1μmol/L。根据测得的IC50值,为确保在暴露的时间段内50%以上的细胞能够存活,将分化的SH-SY5Y细胞暴露于1/2和1/4 IC50浓度下,与对照组相比,分化的神经细胞暴露于 CAA48小时后,细胞形态呈现剂量依赖性裂解,细胞数量显著减少(P<0.05);与对照组相比,分化的神经细胞暴露于2,6-DCBQ48小时后,细胞数量同样显著减少(P<0.05)。通过免疫荧光分析检测β-tubulin蛋白表达情况,低荧光信号表明 CAA和2,6-DCBQ均破坏了细胞的形态并抑制了β-tubulin的表达。将分化的 SH-SY5Y细胞暴露于相同等效生物浓度的 CAA和2,6-DCBQ(IC50的1/2和3/4)48小时后,通过流式细胞仪对细胞周期的分析结果表明,CAA导致分化的SH-SY5Y细胞出现了S期细胞周期阻滞现象(P<0.05)。同样,暴露于2,6-DCBQ的神经分化 SH-SY5Y细胞亦出现了 S期细胞周期阻滞(P<0.05)。并且,2,6-DCBQ对神经分化 SH-SY5Y细胞的细胞活力和细胞周期的影响比CAA更为明显(P<0.05)。
结论:本研究表明CAA和2,6-DCBQ均能破坏未分化和分化的SH-SY5Y神经细胞的形态结构、细胞活力和增殖。两种DBPs均能引起分化神经细胞中S期细胞周期阻滞现象,但只有2,6-DCBQ能引起未分化神经细胞的S期细胞周期停滞现象。两种DBPs均影响SH-SY5Y细胞的神经分化。因此,CAA和2,6-DCBQ的潜在神经发育毒性需要更多的研究才能完全了解其毒性作用的相关机制。
尽管已有部分关于氯乙酸(CAA)和2,6-二氯-1,4-苯醌(2,6-DCBQ)的神经发育毒性的相关研究报告,但对于 DBPs的神经毒性,我们的了解依然较少。CAA是一种有机酸,广泛存在于饮用水配水系统中,含量约为2-82μg/L。美国和欧盟国家已将CAA在水中浓度限定为0.07 mg/L。目前有研究报告 CAA能够影响培养的神经细胞的发育。同时,研究报道2,6-DCBQ作为新型的卤代苯醌(HBQs)类 DBP,在氯化饮用水中不断被发现,浓度范围常为4.5-274.5 ng/L。2,6-DCBQ能够影响人神经干细胞的分化并引起 S期细胞周期停滞,但是 CAA和2,6-DCBQ类消毒副产物尚未在中国和世界其他地区受到专门监测和管理。
目的:研究 CAA和2,6-DCBQ对未分化和分化的神经元 SH-SY5Y细胞的毒性作用。因目前中国尚未制定相关的标准进行监管,但二者在饮用水中的被频繁检测出来,结合最近报告的关于二者的神经发育毒性,本研究选择 CAA和2,6-DCBQ作为主要研究对象。
方法:本研究方法分为两部分,第一部分为对未分化的 SH-SY5Y细胞进行的实验。将未分化的 SH-SY5Y细胞在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、1 mg/mL链霉素的 DMEM中培养,采用 MTT测定法间接检测暴露于 CAA或2,6-DCBQ24、48和72小时后未分化的神经元 SH-SY5Y细胞的活力和增殖。采用光学显微镜观察暴露于 CAA或2,6-DCBQ72小时后未分化神经元 SH-SY5Y细胞的形态变化。最后,采用流式细胞仪对未分化的细胞进行细胞周期时象分析,以评估 CAA和2,6-DCBQ对未分化细胞的细胞周期的影响。
第二部分为对神经分化的SH-SY5Y细胞进行的实验。SH-SY5Y细胞的神经分化通过将细胞暴露于10μmol/L的维甲酸(RA)中诱导48小时。MTT测定法间接检测暴露于CAA或2,6-DCBQ24、48和72小时后,分化的 SH-SY5Y细胞的活力和增殖。将细胞暴露于CAA或2,6-DCBQ下48小时后,进行光学显微镜和免疫荧光显微镜观察,并检测分化的 SH-SY5Y神经元细胞的β-微管蛋白(β-tubulin)的表达、神经生长及细胞形态。最后,采用流式细胞仪对分化的细胞进行细胞周期时象分析,以确定 CAA和2,6-DCBQ对分化细胞的细胞周期的影响。
结果:第一部分结果包括 CAA和2,6-DCBQ对未分化的 SH-SY5Y细胞形态、活力、增殖和细胞周期的影响。通过MTT测定暴露24、48和72小时后未分化的SH-SY5Y细胞,获得细胞生长曲线、剂量-反应关系和半数抑制浓度(IC50);CAA在24、48和72小时的IC50分别为1066±80、639±34和610±61μmol/L,而2,6-DCBQ为41±6、33±4和35±6μmol/L。未分化的 SH-SY5Y细胞暴露于相同等效生物浓度的 CAA(IC50的1/2和1/4:533和266μmol/L)和2,6-DCBQ(IC50的1/2和1/4:20和10μmol/L)会严重影响未分化的 SH-SY5Y细胞形态、细胞活力和增殖。细胞周期分析结果表明,暴露于相同等效生物浓度的 CAA(IC50的1/2和3/4:533和800μmol/L)和2,6-DCBQ(IC50的1/2和3/4:20和30μmol/L)后,2,6-DCBQ引起了未分化细胞的 S期细胞周期阻滞现象(P<0.05),而 CAA未引起细胞周期的改变,因此,在未分化的 SH-SY-5Y细胞中,相比CAA,2,6-DCBQ具有更大的细胞毒性。
本研究第二部分的结果为CAA和2,6-DCBQ对神经分化的SH-SY5Y细胞形态、活力、增殖、β-tubulin的表达和细胞周期的影响。通过 MTT测定暴露24、48和72小时后的分化的神经细胞,获得细胞生长曲线、剂量-反应关系和半数抑制浓度(IC50);CAA在24、48和72小时的IC50分别为718±74、679±71和514±61μmol/L,而2,6-DCBQ为35±0.4、29±1和27±1μmol/L。根据测得的IC50值,为确保在暴露的时间段内50%以上的细胞能够存活,将分化的SH-SY5Y细胞暴露于1/2和1/4 IC50浓度下,与对照组相比,分化的神经细胞暴露于 CAA48小时后,细胞形态呈现剂量依赖性裂解,细胞数量显著减少(P<0.05);与对照组相比,分化的神经细胞暴露于2,6-DCBQ48小时后,细胞数量同样显著减少(P<0.05)。通过免疫荧光分析检测β-tubulin蛋白表达情况,低荧光信号表明 CAA和2,6-DCBQ均破坏了细胞的形态并抑制了β-tubulin的表达。将分化的 SH-SY5Y细胞暴露于相同等效生物浓度的 CAA和2,6-DCBQ(IC50的1/2和3/4)48小时后,通过流式细胞仪对细胞周期的分析结果表明,CAA导致分化的SH-SY5Y细胞出现了S期细胞周期阻滞现象(P<0.05)。同样,暴露于2,6-DCBQ的神经分化 SH-SY5Y细胞亦出现了 S期细胞周期阻滞(P<0.05)。并且,2,6-DCBQ对神经分化 SH-SY5Y细胞的细胞活力和细胞周期的影响比CAA更为明显(P<0.05)。
结论:本研究表明CAA和2,6-DCBQ均能破坏未分化和分化的SH-SY5Y神经细胞的形态结构、细胞活力和增殖。两种DBPs均能引起分化神经细胞中S期细胞周期阻滞现象,但只有2,6-DCBQ能引起未分化神经细胞的S期细胞周期停滞现象。两种DBPs均影响SH-SY5Y细胞的神经分化。因此,CAA和2,6-DCBQ的潜在神经发育毒性需要更多的研究才能完全了解其毒性作用的相关机制。