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目的:神经保护药物是治疗神经系统疾病的重要治疗方法,具有极为广阔的开发与应用空间,现已证明证明钙拮抗剂尼莫地平对于急性缺血性脑血管病的死亡率无明显改善。替拉扎特治疗组卒中的随机对照的临床试验由于缺乏效果已被提前停止。氧自由基清除剂依达拉奉尚没有足够的临床试验证明其神经保护作用,目前人类已将众多中药应用于神经系统疾病的临床研究,目前尚缺乏证据证明其临床有效性,人类仍在积极地致力于神经保护药物的开发与研究,在自然界中寻找具有神经保护作用的化合物是开发具有神经保护作用药物的重要方法,萜类化合物是一大类植物次生产物的总称,研究显示萜类化合物具有神经保护作用,如樟芝(樟菇,最贵的蘑菇)中提取的五种二萜类化合物,在在体研究中适当浓度时表现了神经保护作用。紫杉醇是最初自红豆杉树皮中提取的一类复杂的二萜类化合物,具有含氧四环的紫杉烷环及酯侧链结构。人们对其抗肿瘤作用及其构效关系进行了深入、广泛的研究,发现有些化合物与抗肿瘤作用并无关联,本实验从具有某些结构特征的紫杉烷化合物中筛选具有抗氧化应激作用研究的化合物并对其构效关系进行研究。实验一氧化应激模型的建立目的:应用H2O2处理SK-N-SH细胞建立氧化应激细胞模型。方法:取对数生长期SK-N-SH细胞,调整细胞浓度为1×105/mL,分4组接种于96孔培养板,每组三个复孔,每孔100μL,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,12小时后,加入100μL不同浓度H2O2,使各组H2O2终浓度分别为0、50、100、150μmol/L,继续培养24小时,采用MTT比色法检测各组细胞的细胞活力。结果:三组细胞H2O2的终浓度为50、100、150μmol/L,孵育24 h。随着浓度的增加,细胞活力与正常对照组相比(H2O2浓度为0μmol/L)均有不同程度的下降,细胞活力分别为:(99 + 3.9)%,(70.6 + 2.3)%(p<0.05),(26.1 + 1.1)%(p<0.05)。100、150μmol/L浓度组细胞活力与对照组比较有显著差异(p<0.05)。结论:H2O2对SK-N-SH细胞具有损伤作用,在50-150μmol/L范围内呈浓度依赖关系, 150μmol/L H2O2处理24h后细胞活力为26.1 + 1.1 %,因此将此浓度作为建立细胞模型浓度。实验二筛选具有抗氧化应激活性的紫杉烷化合物目的:筛选具有抗氧化应激作用的紫杉烷类化合物,并分析其构效关系。方法:实验分为空白对照组、阴性对照组、处理组、阳性对照组、正常对照组。取对数生长期Sk-N-Sh细胞,调整细胞浓度为1×105/mL,分别接种于96孔培养板,每孔160μL,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,12小时后,各组细胞加入不同试剂。空白对照组:每孔加入40μL PBS;阴性对照组:每孔加入20μL 1640培养基,2小时后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2终浓度为150μmol/L;处理组:包括Taxine B、7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine A每种药物三个浓度组,共12个亚组,每亚组三复孔。每孔加入20μL不同种类、浓度的化合物,2小时后加入20μL H2O(21.5mmol/L),使H2O2终浓度为150μmol/L ,药物终浓度为1、10和100μmol/L;阳性对照组:每孔加入20μL表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin Gallatte,EGCG) (100μmol/L),2小时后加入20μL H2O(21.5mmol/L),使H2O2终浓度为150μmol/L ,EGCG终浓度为10μmol/L;正常对照组分别加入20μL PBS和20μL浓度为1mmol/L的7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、Taxine B、7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine使四种紫杉烷化合物终浓度均为100μmol/L,共4个亚组。各组细胞处理24小时后MTT法检测细胞活力,HO荧光染色观察细胞核形态。结果:阴性对照组细胞活力27.3±0.85%。7-deacetyl-taxine B化合物浓度1、10、100μmol/L时细胞活力分别是25.9±1.609%,31.2±1.253%,57.6±3.74%(p<0.05);5-cinnamoyloxy-taxin B浓度1、10、100μmol/L时细胞活力分别是25.0±3.79%,32.5±2.458%,54.5±1.682%(p<0.05);Taxine B浓度1、10、100μmol/L时细胞活力分别是28.4±0.603%,30.5±1.967%,31.5±1.308%;7,10-diacetyl-2’-deoxyl-taxine A浓度1、10、100μmol/L时细胞活力分别是27.4±0.751%,32.4±0.971%,34.4±1.852%;EGCG浓度为10μmol/L时细胞活力为45.4±1.168%(p<0.05) ; 100μmol/L7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B以及10μmol/LEGCG处理氧化应激模型细胞后与阴性对照组比较细胞活力显著提高(p<0.05)。正常对照组细胞经过浓度均为100μmol/L的四种化合物7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、Taxine B、7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine处理后,细胞活力分别为102±3.02%,95.4±7.73%,98.4±5.98%,97.8±6%,与空白对照组100±11%比较无显著差异。Hoechst染色显示阴性组大量细胞染色质凝聚; 100μmol/L 7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、10μmol/L EGCG处理后染色质凝聚细胞较阴性对照组明显较少, Taxine B、7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine A处理后减少不明显。结论:本实验选用的四种化合物Taxine B、7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine A均为自紫杉中提取的紫杉烷类化合物,拥有共同的母环结构,具有共同的特点本试验化合物C13位乙酰基取代长侧链,C1位羟基消失,C2位乙酰基代替了苯甲酰基,C4位乙酰基消失,C5位的羟基导致氧丁环消失。他们的区别在于:Taxine B在C5位上含有羟基,C7位上含有乙酰基;7-Deacetyl-taxine B C5、C7位上含有羟基;5-Cinnamoyloxy-taxin B在C7位上含有乙酰基,C5位上含有脂溶性侧链;7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine A在C7位上含有乙酰基,C5位含有碱性性长链基团。结果表明经修饰后的紫杉烷并未表现抗肿瘤作用,可能与他们共同的结构特点有关:C13位取代侧链,C1位取代了羟基,C2位代之以乙酰基,C4位乙酰基消失,C5位代之以羟基导致氧丁环消失。7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B化合物不仅细胞毒性消失,并且使氧化应激细胞模型细胞活力显著提高,表现了抗氧化应激、神经保护作用。其中7-Deacetyl-taxine B抗氧化应激作用强于5-Cinnamoyloxy-taxin B,Taxine B、7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine A较对阴性对照比较无显著性差异。7-Deacetyl-taxine B的抗氧化应激作用最强,可能由于此化合物5、7位上相邻羟基的稳定苯氧自由基结构的作用导致了抗氧化应激作用的增强。本实验SK-N-SH细胞经H2O2处理24h后,Hoechst染色显示阴性组显示大量细胞染色质凝聚; 100μmol/L 7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、10μmol/L EGCG处理后染色质凝聚细胞较阴性对照组明显较少,Taxine B、7,10-Diacetyl-2’-deoxyl-taxine A处理后减少不明显。化合物的抗氧化应激作用可能与阻止细胞质凝集,减少细胞染色质损伤有关。实验三、紫杉烷化合物对于H2O2诱导氧化应激损伤保护的机制研究目的:探讨紫杉烷类化合物抗氧化应激神经保护作用的机制。方法:实验分为阴性对照组和处理组,每组包含3个复孔,每孔加入160μL细胞浓度为1×105/mL的对数生长期细胞,细胞在37℃、5% CO2,饱和湿度下培养,12小时后给予药物干预。对照组:每孔加入20μL 1640培养基,2小时后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2终浓度为150μmol/L。处理组:包括7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B两组,每组三复孔。每孔加入20μL不同种类的化合物,2小时后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2终浓度为150μmol/L ,药物终浓度为100μmol/L。各组细胞处理24小时后,透射电镜观察其超微结构改变,流式细胞术观察其细胞凋亡率的变化、细胞内氧自由基的含量和细胞线粒体膜电位的变化。结果:电镜观察显示:SK-N-SH细胞经H2O2处理后表现了凋亡典型的形态特征:核染色质浓染、边集、凋亡小体形成,还出现了内质网扩张,扩张的内质网内可见少量致密物质,线粒体肿胀;经过紫杉烷化合物7-Deacetyl-taxine B(100μmol/L)、5-Cinnamoyloxy-taxin B(100μmol/L)处理后细胞凋亡现象较对照组明显减少,细胞核染色质边集少、线粒体肿胀均较前者减轻,但内质网改变不明显。Annexin-v/pi染色后对照组细胞中FITC-/pi- (正常细胞) 73.62±2.14%,FITC+/ pi-(早期凋亡)22.06±3.08%;5-Cinnamoyloxy-taxin B处理后FITC-/pi-(正常细胞)83.55±2.34%(p<0.05),FITC+/pi-(早期凋亡)12.68±2.36%(p<0.05);7-Deacetyl-taxine B处理后FITC-/pi-(正常细胞)比84.78±0.75%(p<0.05),FITC+/pi-(早期凋亡)5.84±2.39%(p<0.05)。紫杉烷化合物处理后正常细胞明显增多,早期凋亡数量减少,具有显著性差异(p<0.05)。DCFH-DA染色后流式细胞仪检测荧光强度显示:7-Deacetyl-taxine B处理组1.77±0.12(p<0.05) , 5-Cinnamoyloxy-taxin B处理组2.57±0.05(p<0.05),与对照组细胞荧光强度47.37±2.32比较有显著差异。氧化应激细胞模型经过7-Deacetyl-taxine B, 5-Cinnamoyloxy-taxin B处理后细胞内氧自由基含量显著减少(p<0.05)。Rhodamine123染色后流式细胞检测荧光强度显示对照组细胞荧光强度9.77±1.29,7-Deacetyl-taxine B处理组细胞荧光强度15.5±0.44(p<0.05),5-Cinnamoyloxy-taxin B处理组细胞荧光强度14.93±0.40(p<0.05),紫杉烷化合物处理后细胞荧光强度较对照组比较显著(p<0.05)。结论:1、H2O2可使SK-N-SH细胞的线粒体和内质网肿胀,染色质固缩、浓染、边集,细胞小体形成,H2O2的氧化应激损伤与诱导细胞凋亡有关。2、应用紫杉烷类化合物7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B化合物处理氧化应激细胞模型可使细胞凋亡率明显减少,存活率提高,线粒体肿胀减轻,线粒体膜电位明显提高,说明紫杉烷化合物的抗氧化应激、神经保护作用可能与保护线粒体、减少凋亡有关。3、应用紫杉烷类化合物7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B化合物处理氧化应激细胞模型可使细胞内氧自由基含量明显减少,说明紫杉烷化合物的抗氧化应激、神经保护作用可能与直接清除细胞内氧自由基有关。