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DNA甲基化与植物响应环境的基因表达调控紧密相关。P450家族在植物适应环境中发挥重要作用，但它们是如何响应非生物胁迫的，知之甚少。多年生黑麦草（Lolium perenne），禾本科黑麦草属植物，是优良的牧草和草坪草，温度是限制黑麦草产量和分布的主要因素之一。为研究温度胁迫下多年生黑麦草P450基因的应答及甲基化变化，本研究首先利用Illumina Hiseq2000测序平台，分别对未胁迫（Control Check，CK;22℃）、热胁迫（Heat Stress，HS;40℃）和冷冻胁迫（Cold Stress，CS;-10℃）处理后的多年生黑麦草植株叶片进行RNA-seq测序，获得相应转录组数据库。进一步选取其中一个对温度胁迫应答强烈的P450基因LpCYP72A161，用亚硫酸盐测序法和qRT-PCR检测，分析LpCYP72A161基因在热胁迫、冷冻胁迫及高温后恢复处理后(40℃，5h;22℃C，24h)的甲基化变化与表达的关系，获得如下结果: 一、比较转录组数据分析 1.高通量RNA-seq获得比较转录组数据。共获得了73126个unigene，与公共数据库Blast比对，共计51062个(69.82％)unigene得到功能注释。 2.大量基因响应高温或低温应答。差异表达分析表明，在热胁迫后，共有20183个(27.60％)unigenes表达差异显著，其中15036个上调，5147个下调;冷胁迫后共有14124个unigenes(19.31％)表达差异显著，其中8428个上调，5696个下调。这些差异表达基因主要为多种转录因子、蛋白激酶和细胞色素P450等。 3.大量P450家族基因响应温度胁迫应答。从转录组数据中鉴定了383个P450家族基因，热胁迫处理时，显著差异表达基因有150个(39.16％)，其中80个显著上调，70个显著下调;冷胁迫处理时，显著差异表达基因有116个(30.29％)，其中54个显著上调，62个显著下调。 4.通过对差异表达的基因序列进行注释，显示胁迫诱导的差异表达P450基因主要为CYP51、CYP71、CYP72、CYP76、CYP81、CYP86、CYP97和CYP734家族的基因。其中，基因ID为CL9047.Contig1_All的P450基因，对高温和低温胁迫均应答强烈，表达极显著上调。序列分析显示，该基因与小麦和短柄草CYP72家族基因CYP72A161同源性高达81％，因此，将此P450基因暂命名为LpCYP72A161，并进行甲基化变化分析。 二、LpCYP72A161基因本体甲基化分析 1.克隆LpCYP72A161基因，获得LpCYP72A161基因全长。获得片段2406 bp的基因序列，包含两端非编码区（Untranslated Region，UTR）5UTR83 bp和3UTR137 bp，以及基因本体2193bp。基因本体包含4个外显子和3个内含子，开放读码框1593bp，编码推导的530个氨基酸的蛋白质。 2.亚硫酸盐测序法分析了LpCYP72A161基因上2309bp区域的甲基化状态，覆盖整个基因本体区。基因内只存在CG位点甲基化，且主要集中在外显子区，内含子区甲基化较少。 3.温度胁迫下LpCYP72A161基因本体CG位点甲基化水平下降，高温和低温胁迫甲基化位点变化基本一致，且主要发生在外显子1区。CG甲基化率在CK（对照）为43.95％、HS（高温胁迫）为31.98％，HR（高温后恢复）为36.37％，以及CS（冷冻胁迫）中为37.47％。表明在高温胁迫下，基因甲基化率下降了11.98％，恢复后甲基化水平又上升了4.40％;在低温胁迫下基因甲基化率下降6.48％。结果也显示了高温胁迫对该基因甲基化的影响更大，且恢复后有部分甲基化位点能够回复。甲基化变化主要发生在基因外显子1，与对照CK(41.62％)相比，热胁迫HS(10.27％)、热胁迫恢复HR(27.30％)和冷胁迫CS(27.84％)下，甲基化变化明显。外显子4高甲基化，但受温度影响较小。因此，推测该基因外显子1区的高甲基化可能影响该基因的转录起始，而基因末端（外显子4）的高甲基化对转录延伸影响较小。 三、LpCYP72A161基因甲基化与表达相关性分析 结合RNA-seq数据和qRT-PCR检测结果分析，温度胁迫上调LpCYP72A161基因表达，相应地甲基化水平下降。显示了LpCYP72A161表达水平与基因本体甲基化程度呈负相关，推测主要与外显子1甲基化变化呈负相关。 综上，通过多年生黑麦草转录组比较分析，获得了大量温度胁迫应答基因，包括大量的细胞色素P450基因，该家族可能在植物响应温度胁迫中有重要作用。对其中一个胁迫响应的P450基因LpCYP72A161的甲基化应答模式分析发现，该基因有较高水平的CG甲基化且能灵活地响应温度胁迫，基因本体的甲基化水平与表达丰度呈负相关。并且，基因本体甲基化对基因表达的影响，可能与甲基化在基因上的位置有关。研究结果为进一步探讨环境胁迫、基因甲基化和基因表达之间的关系提供了表观遗传学依据。同时，为揭示P450家族基因在温度胁迫下的重要作用打下基础，并为黑麦草或其它作物的抗逆研究提供了依据和丰富的基因资源。