急性肾损伤（acutekidney injury,AKI）是住院患儿尤其是重症患儿常见的疾病,和患儿的病死率增高明显相关[1]。AKI的病死率居高不下,究其原因与无法早期识别并靶向特定发病机制的精准治疗有关[2]。积极探寻急性肾损伤的发生机制,并从中寻找能够早期识别AKI的生物标志物,对于及时治疗,从而减少AKI病死率具有重要的临床实际意义。早期准确地识别AKI对于改善患者的预后至关重要[3-5]。我们团队一直致力于新生儿和儿童急性肾损伤标志物的研究。在通过Liqui Chip液相蛋白芯片技术检测与炎症损伤密切相关的因子时,我们发现肾缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）大鼠的血清和肾组织中白细胞介素-33（interleukin-33,IL-33）和金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-2）明显升高。IL-33是白细胞介素-1（interleukin 1,IL-1）家族的成员,它的特异性受体是肿瘤发生抑制蛋白2（suppression oftumorigenicity2,ST2）。作为IL-1受体家族成员,ST2主要有膜结合形式（ST2L）和可溶性（sST2）亚型。在组织损伤后,IL-33通过结合ST2L来激活机体的免疫应答。而sST2与IL-33结合后,可拮抗IL-33的作用[6]。研究显示,IL-33和ST2在多种肾脏疾病模型中的表达均升高[7,8]。然而迄今为止尚无IL-33、sST2与急性肾损伤的临床研究。故我们拟通过单中心和多中心临床研究,分析血IL-33、sST2水平与重症儿童AKI的关系,探究血IL-33、sST2水平对重症儿童AKI诊断及预后判断的意义。作为细胞周期阻滞蛋白,TIMP-2在肾脏缺血或炎症损伤早期即参与肾小管上皮细胞G1周期阻滞[5]。针对成人的研究显示,尿TIMP-2与同为细胞周期阻滞蛋白的胰岛素样生长因子结合蛋白 7（insulin-like growth factor binding protein-7,IGFBP-7）的联合应用（尿[TIMP-2]·[IGFBP-7]）是诊断AKI或重度AKI的敏感指标[9-11]。但在新生儿中,缺乏证据证实这些生物标志物与AKI之间的关联。由于围生期缺氧室息、感染等因素的影响,重症新生儿较儿童更容易发生AKI,且新生儿AKI的病死率明显高于儿童。然而与儿童使用的诊断标准相比,新生儿AKI的诊断更具有挑战性。为此,通过针对重症新生儿建立前瞻性临床队列研究,我们分析尿TIMP-2、IGFBP-7及[TIMP-2]·[IGFBP-7]水平与AKI、重度AKI的相关性,并探究这些生物标志物在重症新生儿AKI诊断中的意义。通过第一部分的临床研究我们发现血sST2水平和重症儿童肾损伤的发生显著相关。但IL-33/ST2在肾损伤中如何被调控的研究目前极少。缺血再灌注损伤是AKI的病理生理基础[12]。多种细胞损伤、死亡途径涉及其中,包括自噬、凋亡、坏死、焦亡和铁死亡等[13,14]。铁死亡是近些年被提出来的一种铁依赖性调节性死亡[15]。有研究显示,相较其他死亡模式,铁死亡多表现为线粒体萎缩、膜密度凝聚和线粒体嵴的减少,在肾损伤中起着重要的作用[16]。然而针对铁死亡在肾损伤进展中的作用机制鲜有报道。炎症反应是缺血再灌注肾损伤的重要环节。研究证实在损伤和炎症打击时,IL-33靶向结合自然杀伤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等表面的ST2L,诱导髓样分化分子、IL-1相关蛋白激酶等聚集,进一步激活下游核转录因子κB（nuclear transcriptionfactor-κB,NF-κB）信号通路[6]。铁死亡是否通过介导IL-33/ST2调控肾损伤,目前未见报道。我们设想在急性肾缺血再灌注损伤时,肾小管上皮细胞发生铁死亡,IL-33表达上调,IL-33通过与ST2L结合,激活下游NF-κB,引起肾小管上皮细胞的炎症性损伤,进而加重肾损伤。因此,第二部分我们主要探讨铁死亡、IL-33/ST2在急性肾损伤中的表达及相关分子机制。通过以上两部分研究,我们旨在探究AKI相关标志物,并分析涉及其中的机制。为儿童AKI的诊疗提供新的切入点。第一部分儿童急性肾损伤生物标志物的相关性研究一、血sST2和重症儿童急性肾损伤及预后的相关性分析目的:通过单中心和多中心临床前瞻性研究,分析血sST2 水平和AKI及预后的相关性;探究血sST2对重症儿童AKI的诊断及预后判断价值。方法:（1）参与机构:单中心临床研究:研究人群:苏州大学附属儿童医院重症监护病房（pediatric intensive care unit,PICU）的患者。研究时间:2019 年 9 月至 2020 年 02 月。多中心临床研究:研究人群:苏州大学附属儿童医院、安徽省儿童医院、复旦大学附属儿科医院、徐州儿童医院重症监护病房的患者。研究时间:2020年9月至2021年02月。（2）统计指标:第三代小儿死亡危险评分;住PICU期间患儿的临床资料;住PICU期间治疗用药情况以及疾病的转归。（3）样本的收集和检测:单中心研究收集患儿住PICU前5天每日的血标本,多中心研究收集患儿住PICU第1天血标本。通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定标本中IL-33、sST2的浓度。（4）分组:根据住PICU期间患者是否发生AKI将其分为AKI组和非AKI组;根据患者是否发生脓毒症将其分为脓毒症组和非脓毒症组;根据患者是否发生脓毒症相关急性肾损伤（sepsis associated AKI,SA-AKI）将其分为非脓毒症非AKI的对照组、脓毒症组、AKI组和SA-AKI组;根据患者是否死亡将其分为死亡组和存活组。（5）分析:通过单中心研究,比较不同时间点血sST2的水平,分析入PICU前5日以及5日内最大的血sST2 水平和AKI、脓毒症以及病死率的相关性。多中心研究检测入PICU第1日的血sST2水平,进一步探究验证血sST2水平和AKI、SA-AKI及预后的相关性。通过线性回归分析血sST2水平与重症儿童临床各指标的线性关系;通过Logistic回归分析血sST2水平与AKI、脓毒症和死亡的相关性;利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）和曲线下面积（area under the curve,AUC）值,评估血sST2对重症儿童AKI、SA-AKI的诊断价值及预后判断价值。结果:1.单中心临床研究（1）共纳入159例患者,其中发生AKI29例（18.2%）,脓毒症67例（42.1%）,死亡27例（17.0%）。多元线性回归分析显示血sST2水平与AKI、脓毒症和死亡有相关性。（2）与非AKI组比较,AKI组患儿各时间点血sST2水平均明显升高。多因素Logistic回归分析显示血sST2水平和AKI显著相关。不同时间点血sST2水平鉴别AKI与非AKI的AUC值无统计学差异。第1天血sST2水平鉴别AKI与非AKI的AUC值是0.812,为5天中最大。下一步多中心研究检测入PICU第1天的血sST2水平进行分析。（3）除了第5日,脓毒症组患儿血sST2水平均高于非脓毒症组。血sST2水平对脓毒症与非脓毒症的鉴别效能较低,第1天血sST2鉴别脓毒症与非脓毒症的AUC值为0.691。因研究显示血sST2水平和AKI、脓毒症均有相关性,下一步多中心研究拟分析血sST2水平和SA-AKI的相关性。2.多中心临床研究（1）共纳入852例患者,其中发生AKI90例（10.6%）,脓毒症131例（15.4%）,死亡71例（8.3%）,SA-AKI34例（4.0%）。多元线性回归分析显示血sST2水平和体重、PRISM Ⅲ评分、脓毒症和AKI相关。（2）AKI组血sST2水平明显高于非AKI组。多因素Logistic回归分析显示血sST2水平和AKI显著相关。在重症儿童中,血sST2鉴别AKI与非AKI的AUC值为 0.811（95%CI:0.764-0.859,P＜0.001）,当血 sST2 取截断值为 111.0 ng/mL 时,其鉴别AKI与非AKI的灵敏度为82.2%,特异度为67.8%。（3）脓毒症组血sST2水平明显高于非脓毒症组。多因素Logistic回归分析显示血sST2水平和脓毒症显著相关。在重症儿童中,血sST2鉴别脓毒症与非脓毒症的AUC 值为 0.733（95%CI:0.685-0.780,P＜0.001）,当血 sST2 取截断值为 142.7ng/mL时,其鉴别脓毒症与非脓毒症的灵敏度为63.4%,特异度为72.1%。（4）SA-AKI组患儿血sST2水平较其他三组（非脓毒症非AKI的对照组、单纯脓毒症组、单纯AKI组）明显升高。多因素Logistic回归分析显示血sST2水平与SA-AKI显著相关。在重症儿童中,血sST2鉴别SA-AKI的AUC值为0.885（95%CI:0.828-0.943,P＜0.001）,当血 sST2 取截断值为 258.4 ng/mL 时,其鉴别 SA-AKI 的灵敏度为79.4%,特异度为82.9%。（5）死亡组患儿血sST2水平明显高于存活组。二元回归分析显示,血sST2水平和患儿死亡有相关性;然而在校正其他影响因素后,血sST2水平和死亡无相关性。结论:血sST2水平和重症儿童AKI、SA-AKI在校正体重和疾病严重程度后依然显著相关。在重症儿童中,血sST2对AKI与非AKI具有一定的鉴别能力;对SA-AKI具有更好的鉴别价值。二、尿TIMP-2、IGFBP-7和重症新生儿急性肾损伤的相关性分析目的:探讨尿 TIMP-2、IGFBP-7 及[TIMP-2]·[IGFBP-7]水平与 AKI、重度 AKI 的相关性,并分析这些生物标志物对重症新生儿AKI、重度AKI的诊断价值。方法:（1）研究对象:苏州大学附属儿童医院新生儿重症监护病房（neonatalintensive care unit,NICU）在2016年7月至10月期间收治的重症新生儿。（2）统计指标:①临床基本情况;②母亲孕期和围生期情况;③住NICU期间治疗用药情况。（3）样本的收集:在入NICU 24小时内收集首次尿液样本,其后每48-72小时收集一次尿液样本。通过ELISA测定尿TIMP-2、IGFBP-7的水平。（4）新生儿AKI的诊断标准:符合以下条件中的任意一项即可诊断①新生儿改善全球肾脏病预后组织（Neonatal Kidney Disease:Improving Global Outcomes,KDIGO）的血肌酐（serum creatine,sCr）标准:sCr 48 小时内升高≥0.3 mg/dL 或 7天内升至基线值的1.5倍以上[66]。血肌酐基线值定义为既往最低血肌酐值;②sCr＞1.2 mg/dL[67]。（5）分组:根据患者AKI的发生情况,将其分为非AKI组,轻度AKI组和重度AKI组。将新生儿KDIGO 1期定义为轻度AKI;将新生儿KDIGO 2期和3期定义为重度AKI。（6）分析:我们检测了入NICU后2周内收集的所有尿标本中的TIMP-2、IGFBP-7和Cr的浓度,并对AKI患儿在确诊AKI前0-5天采集的尿液样本以及非AKI患儿入NICU后两周内随机采集的尿液样本中的尿TIMP-2、尿IGFBP7和尿[TIMP-2]·[IGFBP-7]水平进行分析。采用线性回归分析各生物标志物和临床指标之间的相关性。在校正各因素后,通过Logistic回归分析各指标和AKI及重度AKI的相关性。采用ROC曲线及AUC值评价各指标对AKI或重度AKI的鉴别价值。结果:（1）237患者中发生AKI20例（8.4%）,其中重度AKI9例（3.8%）。非AKI组尿IGFBP-7水平明显低于轻度和重度AKI组;而尿[TIMP-2]·[IGFBP-7]水平在重度AKI组最高。（2）尿IGFBP-7水平和AKI存在相关性,尿[TIMP-2]·[IGFBP-7]水平与重度AKI有明显的相关性。在重症新生儿中,尿[TIMP-2]·[IGFBP-7]鉴别重度AKI与非重度AKI的AUC值为0.71,在最佳临界值为0.045（ng/mL）2/1000时,其鉴别重度AKI与非重度AKI的灵敏度为88.9%,特异度为50.9%。结论:在重症新生儿中,联合应用尿TIMP-2和IGFBP-7对重度AKI具有较好的鉴别价值。第二部分IL-33/ST2在大鼠缺血再灌注肾损伤中的表达及机制的初步探讨目的:探讨大鼠肾缺血再灌注损伤时IL-33/ST2的表达以及铁死亡、IL-33/ST2在其中的作用。方法:（1）建立大鼠肾IRI模型:将大鼠分为:正常组、假手术组和手术组。手术组大鼠缺血45分钟后再灌注,在再灌注不同时间点（IRI 1h,IRI3,IRI6h和IRI24h）留取大鼠血清和肾组织。分别检测各组血肌酐水平并观察肾脏病理改变。（2）IRI不同时间点细胞因子的表达:应用Liqui Chip液相蛋白芯片技术,检测缺血再灌注不同时间点AKI相关的细胞因子在大鼠血清中的表达。（3）研究IL-33、ST2在肾缺血再灌注损伤时的表达:建模后通过Western blot技术检测肾组织中IL-33、ST2蛋白的表达水平,利用ELISA技术检测大鼠血清中IL-33、sST2的浓度。（4）验证IRI时肾脏发生铁死亡和脂质过氧化:利用Western blot技术检测肾组织长链脂酰辅酶A合成酶（Long-chain acyl-CoA synthetase 4,ACSL4）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidases4,Gpx4）、4-羟基壬烯酸（4-hydroxy-nonanoicacid,4HNE）的表达水平。通过电镜观察肾脏是否发生铁死亡形态的改变。并检测肾组织过氧化脂质（lipid peroxide,LPO）和三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate,ATP）的水平。（5）研究铁死亡诱导剂、抑制剂对IRI肾损伤的影响:分别给予大鼠铁死亡诱导剂RSL3（（1S,3 R）-RSL3）或铁死亡抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-1-cysteine,NAC）预处理,24小时后建立IRI24h模型。检测大鼠肾脏病理改变和铁死亡指标的变化。（6）研究IRI时铁死亡诱导剂、抑制剂对IL-33、ST2的影响:分别给予RSL3或NAC预处理,24小时后建立IRI24h模型。利用Western blot技术检测肾组织IL-33和ST2蛋白的表达,通过ELISA检测大鼠血清中IL-33和sST2的水平。（7）探究铁死亡诱导剂、抑制剂对肾脏核转录因子NF-κB蛋白表达的影响:给予RSL3或NAC预处理,24小时后建立IRI24h模型。检测肾组织磷酸化NF-κB蛋白的表达。结果:（1）成功建立大鼠肾IRI模型。与对照组比较,IRI1h血肌酐开始升高,IRI24h血肌酐达高峰;此时病理可见肾小管上皮细胞水肿明显,刷状缘消失。（2）血清炎症因子的动态变化:IRI 3h大鼠血清中IL-33、趋化因子CXCL5（CXC chemokine Ligand-5,CXCL5）、白细胞介素-12（interleukin 12,IL-12）、白细胞介素-5（interleukin 5,IL-5）的表达即较对照组明显升高。（3）IL-33、ST2的动态表达:IRI 1h,肾脏完整形式的full length IL-33蛋白表达增高;IRI24h,肾脏裂解形式的cleavedIL-33蛋白表达升高。IRI不同时间点肾脏ST2L蛋白的表达无显著变化。IRI 24h,血清中IL-33和sST2的水平明显升高。（4）铁死亡相关指标的动态变化:肾脏4HNE和LPO在IRI3h表达升高,Gpx4蛋白在IRI 6h表达下降,ACSL4蛋白在IRI 24h表达升高。IRI 24h电镜显示肾小管上皮细胞线粒体固缩、密度加深,发生铁死亡形态改变。（5）RSL3预处理后,IRI24h肾脏ACSL4、LPO蛋白的表达进一步升高;肾小管上皮细胞水肿加剧,局部渗血,细胞核脱落更明显。NAC预处理组与之相反。（6）RSL3预处理后,IRI 24h肾脏完整形式IL-33、裂解形式IL-33和ST2L蛋白的表达均增加,血清中IL-33、sST2的水平升高。NAC预处理组后,IRI 24h肾脏完整形式IL-33蛋白表达升高,裂解形式IL-33和ST2L蛋白的表达降低;血清中IL-33、sST2的水平降低。（7）IRI24h,肾脏磷酸化NF-κB蛋白的表达升高;RSL3预处理后,IRI24h肾脏磷酸化NF-κB蛋白的表达进一步升高;NAC预处理后,IRI 24h肾脏磷酸化NF-κB蛋白的表达降低。结论:大鼠肾缺血再灌注损伤时,肾小管上皮细胞发生铁死亡,肾组织IL-33和NF-κB蛋白的表达升高,血清中IL-33和sST2的水平升高。铁死亡诱导剂可上调IL-33、ST2和NF-κB蛋白的表达,致肾组织损伤加重。