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目的:应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术靶向沉默胶质瘤内水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP-4)的表达,观察其对胶质瘤源性脑水肿的治疗效果。
方法:根据NCBI基因数据库检索出大鼠AQP-4的mRNA基因全长,将其编码区用基因沉默设计软件设计siRNA,寡核苷酸序列分别为①5’-AGA TCA GCA TCG CCA AGT C-3’,②5’-TAG GAC CGA AGG CATGAG CGA CAA C-3’,③5′-GCG GAC GCC CAG AAA GAC CTG ATCC-3′。构建沉默AQP-4的siRNA质粒,脂质体介导转染C6胶质瘤细胞,G418进行筛选,免疫荧光化学方法检测siRNA质粒对AQP-4的沉默效果;建立SD大鼠颅内C6胶质瘤模型,分对照组、空载体转染组和AQP-4 siRNA治疗组;提取建模后第3、6、9、12天脑组织总RNA和总蛋白,RT-PCR和Western Blot方法检测AQP-4的mRNA和蛋白表达水平;干/湿比重法和Evans蓝测定法检测大鼠不同时相脑组织含水量和血脑屏障通透性改变;比较动物生存期。
结果:细胞免疫荧光化学结果显示C6胶质瘤细胞胞浆和胞膜有低水平的AQP-4表达,转染3个不同的siRNA后,AQP-4均有不同程度的降低,其中以①5′- AGA TCA GCA TCG CCA AGT C-3′核苷酸序列为siRNA的靶向沉默效果最好。后续体内实验即以此为治疗核苷酸序列。RT-PCR结果显示对照组与空载组胶质瘤随时间延长,肿瘤体积增大,其AQP-4表达水平亦出现增高趋势,但在相同时间点,二组间比较没有统计学差异(P>0.05);治疗组观测全程可见AQP-4呈极低水平表达,在相同时间点与前两组比较均有明显统计学差异(P<0.01)。Western Blot结果与RT-PCR检测结果变化趋势相似,治疗组观测全程可见AQP-4呈极低水平表达,在相同时间点与对照组和空载组比较均有明显统计学差异(P<0.01)。与对照组和空载体转染组比较,AQP-4siRNA治疗组脑组织水含量减少,血脑屏障通透性降低,实验动物获得更长的生存期。
结论:靶向AQP-4的RNAi技术可在一定程度上减轻胶质瘤性脑水肿的发生和发展,为胶质瘤脑水肿提供了一种新的治疗策略选择。