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前言药物通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)一般有两种途径:细胞旁途径和跨细胞途径。根据药物理化性质,亲水性药物以细胞旁途径为主,亲脂性药物以跨细胞途径为主,并且跨细胞途径能够转运与白蛋白大小相似或比其大的血浆蛋白。在正常血脑屏障和血肿瘤屏障(blood-tumor barier,BTB),脑微血管内皮细胞(brain microcapillary endothelial cells,BMECs)具有很低的胞吞转运功能,限制了许多大分子和颗粒性药物进入脑组织和肿瘤组织。如何增加BMECs的跨细胞转运是增加化疗药物进入肿瘤组织,提高化疗疗效的关键。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种促进内皮细胞分裂、血管生成的有丝分裂原,属于生长因子家族,作为最强的血管通透性因子,其增加血管通透性的作用比组胺强50000倍。有研究表明,向局灶性脑缺血组织注射VEGF后血脑屏障通透性增加。通过对内皮细胞超微结构分析认为,VEGF通过细胞质膜微囊(caveolae)发挥作用。Caveolae是细胞质膜表面特异性的内陷囊状结构,是第一个被确定的内皮细胞胞吞成分,他的主要功能是通过细胞质膜的跨细胞途径转运大分子物质或内化小分子物质。VEGF能与内皮细胞内的caveolae结合,在细胞膜上形成一些允许生物大分子通过的“小孔”,促进生物分子的跨膜转运,以此增加血管通透性。但是VEGF能否通过增加跨内皮细胞吞饮小泡的数量增加BTB的通透性及其作用机制目前尚不明确。本研究首先建立大鼠C6脑胶质瘤模型,通过立体定位仪向肿瘤局部注射适当剂量VEGF,应用伊文氏兰(evans blue,EB)的渗透评估VEGF作用前后脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性的变化,透射电镜观察血肿瘤屏障BMECs中吞饮小泡数量的变化,明确VEGF对血肿瘤屏障通透性的影响;并检测质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2在脑肿瘤组织微血管中的分布和表达情况,初步明确VEGF开放血肿瘤屏障的机制,为脑胶质瘤等中枢神经系统疾病的治疗提供新途径。方法1、大鼠C6胶质瘤细胞的培养和C6脑胶质瘤模型的制备。2、应用伊文氏兰的渗透评估VEGF作用前后C6脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性的变化。3、应用透射电镜技术检测C6脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障BMECs中吞饮小泡数量的变化。4、应用免疫组织化学法检测VEGF作用前后C6脑胶质瘤大鼠脑肿瘤组织微血管中caveolin-1和caveolin-2的分布和表达水平变化。5、应用western blot法检测VEGF作用前后C6脑胶质瘤大鼠脑肿瘤组织微血管中caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达水平变化。结果1、成功建立了大鼠C6脑胶质瘤模型。2、分别给予剂量为0.01 ng/g、0.05 ng/g、0.1 ng/g、0.2 ng/g和0.4 ng/g的VEGF,当VEGF剂量为0.05 ng/g时,C6脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性显著增加。3、给予0.05 ng/g VEGF后,C6脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性增加,在VEGF作用45 min时增加最显著,以后逐渐恢复,在VEGF作用120 min时恢复到未给药时水平。4、C6脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障BMECs中吞饮小泡的数量很少,给予0.05 ng/gVEGF作用45 min时,吞饮小泡数量明显增加,在VEGF作用120 min时明显减少。5、给予0.05 ng/g VEGF后,C6脑胶质瘤大鼠脑肿瘤组织微血管中caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达水平增加,二者均在VEGF作用45 min时达峰值,以后逐渐降低,在VEGF作用120 min时降到给药前水平。讨论我们的研究证明,VEGF作用后C6脑胶质瘤大鼠BTB的通透性显著增加,BMECs中吞饮小泡的数量明显增加。同时发现,质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的表达水平显著高于对照组,在VEGF作用45 min时达峰值。上述结果说明,VEGF能够通过增加吞饮小泡数量的跨细胞途径增加BTB的通透性。血管内皮生长因子是首先被描述为来源于肿瘤具有很强的增加内皮细胞通透性的细胞因子,它是目前已知作用最强的促血管生成因子。许多研究表明适当剂量的VEGF能够有效地增加BBB和BTB的通透性。我们应用伊文氏兰的渗透评估BTB的通透性变化时发现,VEGF剂量为0.05 ng/g时,C6脑胶质瘤大鼠BTB的通透性显著增加;并且在VEGF作用45 min时达峰值,以后逐渐恢复,在VEGF作用120 min时恢复到未给药时水平。许多研究者的研究结果与我们的结果相一致。但是关于VEGF究竟是通过细胞旁途径还是跨细胞途径增加BTB的通透性目前还不是很清楚。研究认为,VEGF可选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体,通过介导形成跨细胞间隙、小泡囊状细胞器(vesicular vacuolarorganelle,VVO)和窗孔调节血管内皮细胞通透性,从而增加BTB的通透性。大分子物质可在VEGF的作用下,通过细胞质膜微囊细胞器进行转运。我们应用透射电镜观察VEGF对C6脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障超微结构的影响时发现,C6胶质瘤移植大鼠血肿瘤屏障BMECs中吞饮小泡的数量很少,给予0.05 ng/g VEGF作用45min时,吞饮小泡的数量明显增加,在VEGF作用120 min时明显减少。有研究证明,VEGF与血管内皮细胞吞饮小泡和窗孔形成有关,但是其介导吞饮小泡和窗孔形成和保持的机制尚未明了。跨细胞途径主要通过细胞表面的caveolae介导的囊泡载体的内吞过程实现的,特定的信号可引起caveolae的内吞,并转移到内皮细胞的基膜侧。Caveolin-1是形成caveolae所必需的主要结构蛋白,在调节囊泡运输中起重要作用,它可以通过控制信号分子的活性和定位调节囊泡的分裂、内吞、融合和胞吐作用。为了进一步弄清VEGF增加吞饮小泡数量的机制,我们应用免疫组织化学和western blot等方法检测了VEGF作用前后caveolin-1和caveolin-2的分布和蛋白表达水平的变化。结果显示,VEGF作用后caveolin-1和caveolin-2在C6脑胶质瘤大鼠脑肿瘤组织微血管中的表达水平增加,二者均在VEGF作用45min时达峰值,以后逐渐降低,在VEGF作用120 min时降到给药前水平。由此我们认为,VEGF可能通过上调caveolin-1和caveolin-2的表达增加吞饮小泡的数量,从而增加血肿瘤屏障的通透性。上述结果证明,VEGF作用后血肿瘤屏障通透性和吞饮小泡数量增加,同时质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的表达水平上调。我们首次在分子水平上证明,VEGF能够通过增加吞饮小泡数量的跨细胞途径增加血肿瘤屏障的通透性。但是,VEGF上调caveolin-1和caveolin-2的信号机制有待于进一步研究。结论1、VEGF显著增加血肿瘤屏障的通透性,同时增加血肿瘤屏障BMECs中吞饮小泡的数量。2、VEGF能促进胶质瘤大鼠脑肿瘤组织微血管中caveolin-1和caveolin-2的表达增加,caveolin-1和caveolin-2的表达上调可能是VEGF作用后吞饮小泡数量增加的原因之一。