慢性乙型肝炎(CHB)是一种流行性、进展性传染病。全球慢性HBV感染者约有3.5亿至4亿人,我国属乙型肝炎高流行地区。HBV感染人体后,机体的免疫反应决定疾病的发生、发展与转归,已经证实细胞免疫功能异常是造成HBV持续感染的主要原因之一。治疗的总体目标是:最大限度地长期抑制或消除HBV,减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化,延缓和阻止疾病进展,减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、HCC及其并发症的发生,从而改善生活质量和延长存活时间。本文在参阅国内外相关文献,了解CHB研究进展的基础上,通过临床观察,客观评价补肾清毒法治疗对CHB的临床效果,研究补肾清毒法治疗对提高机体免疫功能,清除HBV的作用机制,探讨补肾清毒方法治疗CHB的可能性,为CHB的免疫调节治疗提供新的临床思路。一文献研究1、本文综述了祖国医学对CHB的病名、病因病机、治疗方法的认识,及现代中医学家在临床上对CHB治疗的研究成果,并总结国内外西医学者对本病的流行病学、病因病理、发病机制、诊断及治疗的研究进展,及目前国内外对CHB研究的趋势及方向。目前认为,CHB患者的免疫应答不能及时清除肝炎病毒,造成慢性感染的主要原因之一是由于DC功能损害,以致HBV特异性细胞免疫功能低下。2、依据伏气温病理论,我们提出慢性乙肝发病机理为“肾虚疫毒内伏肝血”,肾虚疫毒内伏肝血是造成乙肝慢性感染的原因,中医治疗当采用补肾清毒法为其主要治法,HBV持续感染的免疫逃避可能与中医伏气理论“肾虚邪伏肝血”病机存在密切关系。二、临床及实验研究1研究目的:1)评价补肾清毒、INF-α及核苷类似物治疗CHB的临床疗效,探讨补肾清毒法治疗CHB的优势。2)比较正常人与慢性乙肝患者(CHB)外周血单核细胞来源的树突状细胞(dendriticcell DC)功能上的差异,探讨慢性乙肝患者体内HBV持续感染的机制。3)从细胞免疫学角度评价补肾清毒法、核苷类似物、干扰素治疗前后不同时间点CHB患者外周血DC的抗原提呈功能的变化,从而探讨中医治疗CHB的应用前景。2研究方法:1)收集15例慢性乙肝患者,随机分为三组。每组各5例,分别运用中医补肾清毒法、INF-α及核苷类似物进行治疗。核苷酸类似物治疗包括阿德福韦酯及恩替卡韦的治疗。观察治疗前、治疗后三个月、治疗后六个月血清学指标变化,结合CHB患者DC表型与功能探讨补肾清毒法控制HBV持续感染的免疫分子机制。2)正常人及慢性乙肝患者外周血树突状细胞的分离培养:收集入选人员肝素抗凝外周血,用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMC),调整细胞浓度至2×10~6个/孔,接种于6孔细胞培养板,贴壁培养3小时后,获得单核细胞,在添加rhGM-CSF和thIL-4终浓度分别达到100ng/ml和500U/ml,置于37℃、5%CO2细胞培养箱继续培养,至第7天添加rhTNF-α,使其终浓度达到60ng/ml,继续培养至第11天,荧光显微镜下采集成熟DC的图像。3) DC表面分子表达的测定:收集采集的DC,运用流式细胞术检测DC表面标志CD14CD83 CD86 CD80 HLA-DR的表达水平。4) DC刺激Th细胞亚群分泌特异细胞因子能力的测定:DC体外扩增培养至第9天后负载HBsAg,共同培养至11天,取培养上清,采用双抗夹心ELISA法测定培养上清中IL-12、INF-γ、IL-2、IL-5、IL-10的含量。3研究结果:1)分别对三组CHB患者进行HBV-DNA定量及ALT的检测,发现接受治疗前,三组患者两项检测指标无明显差异.治疗3个月后,干扰素与核苷酸类似物治疗组CHB患者HBV-DNA量明显降低,P＜0.05,与治疗前相比有统计学意义;两组疗法之间比较HBV-DNA定量降低程度,核苷类似物治疗组优于干扰素治疗组,但无明显统计学意义;补肾清毒法治疗组CHB患者,HBV-DNA量较治疗前有降低,但P＞0.05,无明显统计学意义;干扰素治疗组与核苷酸类似物治疗组ALT值与治疗前相比P＜0.05,有统计学意义,两组间比较核苷酸类似物治疗组ALT值下降较明显;补肾清毒法治疗组ALT值与治疗前相比有降低趋势,但P＞0.05,无明显统计学意义;治疗6个月后,干扰素治疗组及核苷酸类似物治疗组与治疗3个月时相比,HBV-DNA与ALT量均有降低,但P＞0.05,无统计学意义;补肾清毒法治疗组HBV-DNA与ALT值与治疗前相比较,P＜0.05,有统计学意义;2)分别对三组CHB患者进行DC表型的检测,发现三种方法治疗3个月后,患者DC表面分子表达水平均有不同程度的提高(CD14除外),且个治疗组间比较其提高程度五明显差异;但经治疗6个月后补肾清毒法治疗组表面分子表达水平提高程度优于其他两组。3)分别对三组CHB患者DC分泌IL-12的水平进行检测,发现经治疗3个月后,三组CHB患者DC分泌IL-12水平均有提高,与治疗前相比P＜0.05,有统计学意义。三组治疗方法组间比较无明显差异。治疗6个月后,三组患者DC分泌IL-12水平均显著增加,但补肾清毒法治疗组患者DC分泌IK-12水平略高于其他两组患者,但无明显统计学意义。4)三组CHB患者治疗后,DC经负载HbsAg,检测其表面分子表达水平发现,补肾清毒法治疗组CHB患者治疗后,DC负载HbsAg与未负载HbsAg相比较表面分子表达水平升高,有统计学意义,而其他两组患者经治疗后,负载HbsAg与未负载HbsAg相比较,DC表面分子表达水平有提高,但P＞0.05,无明显统计学意义。对补肾清毒法治疗组CHB患者DC负载HbsAg后,检测其分泌细胞因子的水平,与治疗前相比,无明显统计学意义。4研究结论:1)三种治疗方法均能有效清除HBV并且不同程度上恢复CHB患者肝功能,改善临床症状。且短期内,干扰素与核苷酸类似物治疗法与补肾清毒法治疗相比较,对于清除CHB患者HBV持续感染效果明显。但对于恢复肝功能效果一般。经长期治疗后,补肾清毒与其他两种治疗方法相比较能够更好使CHB患者恢复肝功能,改善临床症状,并且有效清除HBV。这可能与补肾清毒法治疗能够提高机体自身免疫功能,从而清除HBV,恢复肝功能密切相关。2) CHB患者经三种方法治疗后,DC功能能得到明显改善,且经长期治疗后,与其他两组相比,补肾清毒法治疗组对CHB患者DC功能改善略显优势。这可能因为长期干扰素治疗可以出现的不良反应及长期核苷酸类似物治疗产生耐药有关。因此,在CHB长期治疗过程中,补肾清毒法治疗更有临床应用价值。3)接受补肾清毒法治疗的CHB患者,经HbsAg冲击后,其表面分子表达水平显著增高,为中医药结合免疫方法治疗CHB提供理论依据。