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马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)严重威胁茄科作物的生产,揭示PVY与寄主的互作关系,可为研究其致病机理及病害防治提供理论依据。前期研究发现普通烟(Nicotiana tabacum)编码的氯离子通道蛋白CLC-Nt1可能与PVY编码的6K2蛋白互作。本研究旨在通过多种生物化学与分子生物学手段,进一步揭示CLC-Nt1蛋白在PVY侵染过程中的作用机理,主要研究结果如下:(1)通过分段克隆以及无义突变的方法构建了PVY坏死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVY~N)侵染性克隆PVY-S。该侵染性克隆可侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)、普通烟与番茄,并具有和野生病毒相似的致病力。在该侵染性克隆中分别插入表达了外源蛋白GFP、Rosea1及MtPsy2a,可直观监测PVY侵染进程,为研究PVY的致病机理提供一个有利工具。(2)通过病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、CRISPR/Cas9技术、回补实验等方法证明CLC-Nt1蛋白参与植株的生长发育。利用GUS染色进行组织特异性表达分析,表明CLC-Nt1基因在根、茎、叶及花中均表达。通过亚细胞定位分析,发现CLC-Nt1蛋白定位在内质网与COP II小泡。利用对pH敏感的荧光蛋白探针(pHluorin),证明CLC-Nt1蛋白参与调节内质网pH。利用secreted GFP(secGFP)证明CLC-Nt1蛋白参与胞内蛋白分泌途径。(3)通过酵母双杂交(Yeast two hybrid)、共定位分析、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)等方法,证明CLC-Nt1蛋白与6K2蛋白互作。利用对pH敏感的荧光蛋白探针,发现PVY侵染和单独表达6K2蛋白均可引起内质网pH升高。通过病毒介导的基因沉默、CRISPR/Cas9技术、化学抑制剂等方法,发现CLC-Nt1蛋白功能缺失后PVY的胞内复制以及系统侵染均受到抑制,表明CLC-Nt1蛋白是PVY侵染所必需的一个寄主因子。根据上述结果得出结论:PVY侵染普通烟后通过自身编码的6K2蛋白与普通烟的CLC-Nt1蛋白互作而调节CLC-Nt1蛋白功能,诱导细胞内质网pH升高,利于PVY募集复制囊泡组分,从而促进病毒胞内复制与系统侵染。本研究首次证明植物的CLC蛋白具有调节细胞器内pH的功能,并首次从胞内pH的角度分析植物病毒与寄主的互作关系,为今后作物抗病毒药物的开发提供新的思路。