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前言脑胶质瘤是神经系统肿瘤中发病率和死亡率最高的肿瘤,占颅内肿瘤的40%左右,但其病因并不十分清楚。在胶质瘤的化疗方面给予血肿瘤屏障（blood-tumorbarrier,BTB）开放剂后给药能够有效地提高化疗疗效。BK（Bradykinin,BK）能够非选择性地增加血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的通透性。其机制可能是:BK与B2受体特异性结合,导致细胞内Ca2+增多,促使细胞内NO及cGMP浓度增加,使肿瘤毛细血管内皮细胞内转运小泡增多,或使血管内皮细胞间的紧密连接（tightjunction,TJ）开放,进而增加血脑屏障的通透性。最近发现,颈内动脉注射罂粟碱（papaverine,PA）,可以通过抑制血管平滑肌收缩而缓解血管痉挛,同时可能会导致血脑屏障通透性的破坏。其分子机制可能是通过抑制平滑肌细胞中cAMP或cGMP磷酸二脂酶的活性而使得细胞间cAMP或cGMP浓度升高。一些炎性物质可以引起动脉平滑肌紧张程度的降低从而引起血管舒张以及静脉压的升高或血管内流体静压的升高。这些都可以引起血管内皮细胞间的紧密连接的开放。有研究发现,IL-1β能够引起动物可逆性的血脑屏障损伤。IL-1β引起的血脑屏障通透性的增高是由中性粒细胞介导的,中性粒细胞的缺失会导致此效应的丧失。所以血脑屏障通透性的增高可能与内源性的IL-1β的产生有关。IL-1β促进组织内cGMP的浓集,而cGMP又可以促进Ca2+的释放。IL-18是白介素1家族的成员,在体外,IL-18刺激星形胶质细胞中IL-1β的产生,也可以通过TNF-α引起血单核细胞产生IL-1β和IL-8。一种假说认为IL-18在调节IL-1β方面发挥作用,并且能够直接影响IL-1β在脑部的作用。本研究首先建立大鼠脑胶质瘤模型,颈内动脉给予BK和罂粟碱,通过电镜观察血肿瘤屏障紧密连接的开放程度以及吞饮小泡的数量变化,明确BK和罂粟碱伍用对血肿瘤屏障的开放的影响;同时测定肿瘤组织内IL-1β和IL-18的含量及其与血肿瘤屏障开放程度的关系,为证实IL-1β和IL-18参与开放血脑屏障的机制提供理论上的依据,并为治疗脑胶质瘤提供理论依据和治疗学上的新靶点。材料和方法一、实验材料1、实验动物本研究采用中国医科大学实验动物中心提供的Wistar大鼠160只,均为雌性,体重在180～200g。2、实验细胞株本研究采用大鼠C6胶质瘤细胞株由中国医科大学细胞生物学实验室提供。3、主要试剂兔抗大鼠IL-1β抗体,兔抗大鼠IL-18抗体均购于武汉博士德试剂公司;缓激肽购于美国Sigma Chemical公司;盐酸罂粟碱购于沈阳第一制药厂;辣根过氧化物酶结合羊抗兔免疫球蛋白和SABC法免疫组化试剂盒均购于武汉博士德试剂公司;β-actin,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二次抗体,FITC标记的山羊抗兔二次抗体均购于北京中山公司;伊文思蓝购于日本Fluka公司;常规电镜制备所需试剂由本校电镜室提供。4、主要仪器二氧化碳培养箱;超净工作台;大鼠脑立体定向仪;PurfusorCompact S型微量输液泵;电热恒温干燥箱;电子分析天平;恒温水浴箱;低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;正置荧光显微镜;-80度深低温冰箱;恒温冰冻切片机,液氮罐;Motic Images Advanced3.2图象分析系统;透射电镜。二、实验方法1、建立大鼠C6胶质瘤模型。2、动物处理及分组经大鼠胶质瘤侧颈动脉灌注小剂量缓激肽及/或罂粟碱,应用western blot法测定不同动物处理组（正常组,假手术组,PA组,BK组,PA+BK组,1/2PA+BK组,PA+1/2BK组,1/2PA+1/2BK组）肿瘤部位IL-1β及IL-18蛋白表达水平的变化。3、通过伊文思蓝试验测定血肿瘤屏障通透性。4、电镜观察血肿瘤屏障超微结构的变化。5、应用Western blot法及免疫组织化学SABC法测定各不同给药组肿瘤组织IL-1β、IL-18蛋白的分布和表达。6、图象分析Western blot结果用Chemi Imager5500V2.03软件扫描,用FluorChen2.0软件定量分析显色带的IDV值。免疫组化结果用Motic Images Advanced 3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。7、统计学处理所有数值均以均数±标准差表示,实验数据采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果一、血肿瘤屏障通透性的变化通过伊文思蓝试验发现,PA组,BK组,以及PA+BK组肿瘤部位组织蓝染,而空白组及假手术组未见蓝染。与空白组（0.244541±0.042274μg/g）及假手术组（0.345083±0.04982μg/g）的EB含量相比,其他各组脑组织中EB含量均升高,其中PA+BK组最高,为0.960309±0.071750μg/g（P＜0.05）,其次为1/2PA+BK组（0.732120±0.067341μg/g,P＜0.05）,BK组（0.663774±0.036010μg/g P＜0.05）,PA组（0.603132±0.34442μg/g,P＜0.05）。二、电镜观察血肿瘤屏障超微结构的变化电镜观察发现空白组及假手术组血肿瘤屏障都没有开放,单独给与罂粟碱（PA）及缓激肽组（BK）血脑屏障部分开放,罂粟碱与缓激肽（PA+BK）伍用组血脑屏障明显开放,1/2PA+BK组及PA+1/2BK组血脑屏障部分开放,1/2PA+1/2BK组血脑屏障未见开放。三、Western Blot法测定给药后肿瘤组织IL-1β和IL-18蛋白的表达测定结果均采用各组IDV值与其内对照β-actinIDV值的比值,空白组及假手术组只表达少量的IL-1β;给药后脑肿瘤表达IL-1β均增加,其中PA组脑肿瘤组织表达的IL-1β值为0.98570±0.04475（n=8,p＜0.05）;BK组脑肿瘤组织表达的IL-1β值为1.16340±0.08745（n=8,p＜0.05）;PA+BK组脑肿瘤部位表达的IL-1β最多,值为1.54100±0.08417（n=8,p＜0.05）;1/2PA+BK组及PA+1/2BK组肿瘤表达的IL-1β减少,与PA及BK组相比无统计学意义,1/2PA+1/2BK组肿瘤表达的IL-1β较少。各组大鼠脑中IL-18的表达趋势和IL-1β相似,空白组及假手术组只表达少量的IL-18;给药后脑肿瘤表达IL-18增多,PA组为0.97839±0.07478（n=8,p＜0.05）;BK组为0.99791±0.06956（n=8,p＜0.05）;PA+BK组脑肿瘤部位表达的IL-18最多,值为1.61476±0.08623（n=8,p＜0.05）;1/2PA+BK组肿瘤部位表达的IL-18值为1.19166±0.07203（n=8,p＜0.05）;PA+1/2BK组及1/2PA+1/2BK组肿瘤部位表达的IL-18较少,只与空白组相比有统计学意义。四、免疫组化法测定肿瘤微血管上IL-1β和IL-18蛋白的表达空白组和假手术组也基本没有阳性表达,给PA后,肿瘤微血管上略有IL-1β表达,其IDV值为0.02580±0.00442（n=6,p＜0.05）;BK组的IDV值为0.02660±0.00423（n=6,p＜0.05）;PA+BK组肿瘤微血管上IL-1β表达最高,IDV值为0.03980±0.00425（n=6,p＜0.05）;1/2PA+BK组及PA+1/2BK组IL-1β表达少,与PA/BK组相比无统计学意义;1/2PA+1/2BK组肿瘤微血管基本没有IL-1β阳性表达。IL-18的表达趋势与IL-1β相似,正常组和未给药组基本没有阳性表达,PA组的IDV值为0.01960±0.00344（n=6,p＜0.05）;BK组的IDV值为0.02660±0.00216（n=6,p＜0.05）;PA+BK组肿瘤微血管上IL-18表达最高,IDV值为0.03600±0.00249（n=6,p＜0.05）;1/2PA+BK组及PA+1/2BK组IL-18表达较少,只与PA组相比有统计学意义;1/2PA+1/2BK组肿瘤微血管IL-18表达很少。讨论本实验利用大鼠胶质瘤模型证明:罂粟碱与缓激肽伍用可以开放血脑屏障,其程度大于单用缓激肽或罂粟碱。细胞因子IL-1β及IL-18的表达量随着血脑屏障开放程度的增加而增加,表明它们在血脑屏障的开放机制中发挥作用。过去研究发现BK和罂粟碱都可以通过cGMP引起血脑屏障开放。BK激活后的下游信号物NO供体,cGMP,以及可溶性鸟苷酸环化酶激活剂可以独立地引起血肿瘤屏障的通透性增加。根据我们的研究结果发现罂粟碱单独使用或者与缓激肽伍用都可以增加血脑屏障的通透性。并且罂粟碱与缓激肽伍用对血肿瘤屏障的开放具有协同作用。目前的研究表明,NO依赖性的Ca2+调节是IL-1β参与的多种信号级联反应中的一部分。NO/cGMP信号系统是细胞内IL-1β导致Ca2+释放的机制中的一部分。脑实质中IL-1的持续性表达增高将会导致选择性的中性粒细胞的增多,而中性粒细胞的增多与血脑屏障的破坏和轴索的脱髓鞘有关。Hu和Fraser发现细胞因子IL-1β能够增强正常情况下血脑屏障对BK的反应。细胞因子IL-1β的表达量随着血脑屏障开放程度的增加而增加。IL-1β可能是BK与罂粟碱引起血脑屏障开放的下游靶点物质之一。但是IL-1β如何通过NO/cGMP信号系统引起血脑屏障开放,在此开放机制中IL-1β的具体作用还不太清楚。我们的实验结果表明,IL-18与IL-1β的变化是一致的,也与随着血脑屏障开放程度的增加而增加。但是具体的机制尚不清楚。综上所述,我们的研究结果提示缓激肽与罂粟碱伍用对血脑屏障开放有协同作用。罂粟碱单用也可以开放血脑屏障。细胞因子IL-1β和IL-18的表达随着血脑屏障开放程度的增加而增加。在临床治疗上可以考虑将缓激肽与罂粟碱伍用作为血肿瘤屏障开放剂,从而使得抗肿瘤药物能够更大程度地到达肿瘤部位,提高疗效。结论1、本研究首次证明,缓激肽与罂粟碱伍用增加了血肿瘤屏障的通透性。2、单独应用罂粟碱,增加了血肿瘤屏障的通透性。3、在缓激肽与罂粟碱伍用增加了血肿瘤屏障的通透性的过程中,细胞因子IL-1β和IL-18的表达显著增加。