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黑虎掌菌（Sarcrodon imbricatus（L.ex Fr.）Karst.）学名枣翘鳞肉齿菌,隶属于担子菌纲多孔菌科多孔菌属,是一类高营养、多活性的药食同源大型真菌资源,主要分布于中欧、北美和亚洲地区,在我国四川、云南、西藏、甘肃和新疆产量最高,已实现大规模人工栽培。黑虎掌菌作为传统药材和健康食品使用已有几千年的历史。祖国医学认为,该菌具有驱风散寒、舒筋活络、降血脂、排毒益气、治风破血等功效。现代医学研究表明,黑虎掌菌能抗癌、解毒、缓解肝硬化,是理想的保健食品之一。国内外对黑虎掌菌的研究相对较少,主要侧重于化学成分分析、多糖提取、菌株液体发酵培养条件优化、抑菌及抗肿瘤活性,缺乏对黑虎掌菌药理药效及作用机制的深入挖掘。迄今为止,有关黑虎掌菌在免疫调节和提升造血功能方面的研究还未见报道。本论文以黑虎掌菌子实体为实验原料,系统分析了黑虎掌菌子实体干品的活性成分及含量分布。在此基础上,我们以黑虎掌菌子实体多糖（SIPS）为研究对象,采用细胞和分子生物学等技术手段,结合体内和体外实验探究SIPS的免疫调节和恢复骨髓造血的能力,初步阐明SIPS发挥相应药理活性的分子学机制,主要结论归纳如下:黑虎掌菌子实体的总糖含量占干重的35.22%,其次是粗纤维23.28%,总蛋白18.33%,甘露醇9.41%,总灰分9.30%,总甾醇3.16%,维生素0.44%,脂肪仅占3.02%;总黄酮(2.05×10-2%)、总多酚（0.41%）和总三萜(4.12×10-2%)类化合物含量略少;在矿物质元素中,钾含量最高,为39.57×10-22 mg/100 g子实体,其次是铁（78.42 mg/100 g子实体）和钙（68.04 mg/100 g子实体）,且重金属含量均未超标;检测结果显示,黑虎掌菌子实体由17种氨基酸（12.44%）、24种脂肪酸组成,涵盖8种人体必需氨基酸,占总氨基酸的4.35%。本论文利用脱色、热水浸提、除蛋白和醇沉的方法,从黑虎掌菌子实体中提取粗多糖,经DEAE-52离子交换柱层析分级纯化,获得纯度为86.8%的SIPS。高效液相色谱（HPLC）显示,SIPS为非均一性多糖,其相对分子质量在56331.8Da93963.6 Da;傅里叶红外光谱（FT-IR）显示,SIPS在3365.8 cm–1处存在O-H伸缩振动吸收峰,2922.2 cm–1处存在C-H伸缩振动吸收峰,1597.1 cm–1存在一较强的糖环吸收峰,1398.4 cm–1处存在C-H变角振动吸收峰和1028.4 cm–1处由C-O-H和C-O-C拉伸引起的C-O弯曲振动,12001000 cm–1之间出现三个较弱吸收峰,说明存在吡喃环骨架结构,这些都是多糖的典型特征吸收峰。本论文首先考察了SIPS对环磷酰胺（CTX）诱导的免疫抑制模型小鼠免疫系统功能的影响。SIPS灌胃治疗免疫抑制小鼠28天后,检测小鼠的体重、脾脏指数、胸腺指数、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞转化能力以及免疫相关细胞因子水平,分析Nrf2蛋白及下游抗氧化酶系统的表达情况,揭示SIPS发挥免疫调节作用的分子学机制。结果显示,相比于模型组,经SIPS给药治疗后,免疫抑制小鼠的体重和脾脏指数恢复正常,NK细胞杀伤活性及T淋巴细胞转化能力显著上升。同时SIPS能够促进免疫抑制小鼠血清和脾脏中免疫球蛋白A（IgA）、IgG、IgM、白介素2（IL-2）、IL-6、IL-10、IL-12和干扰素γ（IFN-γ）的分泌,显著降低免疫抑制小鼠脾和胸腺内活性氧（ROS）的积累,提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）的水平以及酸性磷酸酶（ACP）和溶菌酶（LZM）的活性。病理切片证实SIPS减轻了免疫抑制小鼠脾脏内多核巨细胞和炎症浸润现象,且western-blot分析结果显示,经SIPS治疗后的免疫抑制小鼠脾脏中Nrf2及下游抗氧化酶SOD1、SOD2、血红素氧化酶1（HO-1）、CAT和II型解毒酶（NQO1）的蛋白表达水平均显著上调,表明SIPS可能是通过调控Nrf2介导的氧化应激信号通路改善由CTX诱导的免疫抑制,提示SIPS具有潜在的抗氧化活性。为探究SIPS能否恢复重建骨髓造血功能,我们首先通过体外实验,利用XTT法、联苯胺染色以及流式细胞术（FCM）考察SIPS对K562和CHRF两种造血细胞的细胞活力、细胞分化和凋亡水平的影响。结果表明,SIPS可显著促进两种造血细胞的细胞活力,诱导K562细胞向红系和巨核系的分化,同时上调两种造血细胞中与造血功能相关转录蛋白RSK1p90、c-Myc和ELK1的表达,且不存在细胞毒性,提示SIPS可能是通过上调转录因子的表达进而促进造血细胞的增殖与分化。随后,我们通过建立体内骨髓抑制小鼠模型,探究SIPS对CTX诱导的骨髓抑制小鼠造血系统功能的影响,揭示SIPS提升和重建骨髓造血活性的分子学机制。结果显示,经SIPS灌胃给药28天,骨髓抑制小鼠体重和胸腺指数逐渐回升,脾/肝肿胀现象消退,外周血血象的淋巴细胞（LY）数、中性粒细胞（NE）数以及血红蛋白（HGB）水平明显升高。此外,SIPS能够有效改善骨髓抑制小鼠受损骨髓内的形态结构,缓解脾/肝肿胀程度,诱导骨髓B淋巴细胞的合成,提高造血干/祖细胞（HSCs/HPCs）的增殖能力。抗体芯片和ELISA验证分析结果显示,SIPS显著提高了骨髓抑制小鼠血清和脾脏中IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的水平,抑制了肿瘤坏死因子（TNF-α）、IFN-γ、C-C基序趋化因子1（CCL1）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP1）的分泌,显著上调了骨髓抑制小鼠脾脏中G-CSF、粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）、M-CSF、酪氨酸激酶（JAK2）和信号传导及转录激活因子3（STAT3）的蛋白表达水平,该结果在体外培养的K562,CHRF和原代骨髓单核细胞（BMMNCs）中均得以证实,提示G-CSF调控的JAK2/STAT3信号通路可能是SIPS促进化疗损伤小鼠造血功能重建的主要分子学机制。总之,以上实验研究表明:（1）SIPS对免疫抑制小鼠的免疫功能有明显的促进作用,其机制可能与Nrf2介导的氧化应激途径有关;（2）SIPS对骨髓抑制小鼠的造血功能有明显的改善作用,其机制可能与G-CSF介导的JAK2/STAT3信号转导通路有关。本课题的提出有助于推动黑虎掌菌从健康食品向生物医药研究领域的转变,也将为筛选和研发具有缓解由长期化疗诱发骨髓免疫抑制的候选药物提供新的思路和方向。