论文部分内容阅读
血吸虫病仍然是影响人类健康的重要寄生虫病。现有的免疫学诊断方法主要是用血吸虫成虫粗抗原或虫卵粗抗原检测抗体,材料来源受限,且不能区分现症感染和既往感染,特异性也有待进一步提高。血吸虫疫苗一直是研究热点,但目前仍无突破性进展。血吸虫体被是血吸虫和宿主相互作用的两个主要界面之一,在营养吸收和免疫逃避等多个方面发挥重要作用,被认为是诊断、疫苗和药物的潜在靶点。前期日本血吸虫的体被蛋白质组学研究鉴定了一批体被蛋白质。本研究就是针对其中的Sjannexin（AY813612,AAW25344）、Sj22（AY815492,AAW27224）、Sjinnexin（AY815599,AAW27331）、SjMRLC（AY815219,AAW26951）等4个蛋白质开展相关研究,主要研究内容包括:（1）利用已知的序列进行生物信息学分析,如:信号肽预测、跨膜区域预测、功能位点和结构域预测、同源序列搜索、多序列比对和进化树构建等;（2）基因的原核克隆和表达、重组蛋白质的纯化;（3）重组蛋白免疫原性检测,重组蛋白兔多克隆抗体的制备及评价,基因的虫期转录特异性,蛋白质的虫期表达特异性,蛋白质的免疫定位;（4）蛋白质的诊断价值评价和蛋白质的动物保护性实验。Sjannexin是相对保守的蛋白,与日本血吸虫重要宿主中的同源序列相似性较高,含有4个annexin重复单位结构域;构建了pET-28a/Sjannexin重组质粒,诱导表达获得可溶性蛋白,通过含咪唑的洗脱液纯化,获得了较高浓度和纯度的重组蛋白;Western blot检测表明rSjannexin具有较好的免疫原性;rSjannexin免疫兔多克隆抗体的滴度达到1:256,000;Sjannexin基因在童虫、雌虫、雄虫和合抱成虫中转录水平较高,胞蚴、毛蚴、虫卵中转录水平较低,尾蚴中转录水平最低;Sjannexin主要在尾蚴、童虫、雌虫、雄虫和合抱成虫中表达,而在虫卵中不表达;Sjannexin定位于日本血吸虫雄虫的体被;rSjannexin作为包被抗原,采用生物素亲和素放大系统（BAS-ELISA）检测不同人群血清,敏感度和特异度分别为80%和90%;用rSjannexin免疫小鼠获得了3.82%的减虫率,肝脏减卵率为21.13%,感染后40d～42d粪便减卵率为31.44%,感染后43d～45d粪便减卵率为24.17%,但统计学检验均无差异（p＞0.05）。Sj22是日本血吸虫的特有蛋白,含有1个信号肽;构建了pET-28a/Sj22重组质粒,诱导表达获得不可溶性蛋白,通过尿素纯化,获得了较高浓度和纯度的重组蛋白;Western blot检测显示rSj22具有一定的免疫原性;rSj22免疫兔多克隆抗体的滴度达到1:256,000;Sj22基因在雌虫、雄虫和合抱成虫中转录水平较高,胞蚴、毛蚴、尾蚴和童虫中转录水平较低,而虫卵中无转录;Sj22主要在雄虫和合抱成虫中表达,在雌虫期有少量表达,提示Sj22可能是性别相关基因;免疫定位显示Sj22表达于日本血吸虫雄虫的肠腔,可能是分泌蛋白,这与Sj22含有信号肽相一致;rSj22作为包被抗原,采用生物素亲和素放大系统（BAS-ELISA）检测不同人群血清,敏感度和特异度分别为36.7%和80%;用rSj22免疫小鼠获得了17.28%的减虫率和9.03%的肝脏减卵率,感染后43d～45d粪便减卵率为22.53%,但统计学检验均无差异（p＞0.05）。Sjinnexin与日本血吸虫重要宿主中的同源序列的相似性较低;本研究在原核表达系统中克隆并表达了Sjinnexin的第二个胞外环（loop2,AA228～AA331）,获得不可溶性蛋白,通过尿素纯化,获得了较高浓度和纯度重组抗原片段;Western blot检测显示日本血吸虫感染动物血清（鼠和兔）及日本血吸虫患者血清均较正常动物血清和人血清有不同程度增强,表明其具有较好的免疫原性;Sjinnexin基因在胞蚴、毛蚴、虫卵、尾蚴、童虫、雌虫、雄虫和合抱成虫中均有转录,且水平比较稳定;用rSjinnexin免疫小鼠获得了12.21%的减虫率（p＞0.05）,肝脏减卵率为32.98%（p＞0.05）,感染后40d～42d粪便减卵率为61.32%（p＜0.05）,感染后43d～45d粪便减卵率为53.55%（p＞0.05）,说明其具有一定的抗生殖作用,是潜在的抗生殖疫苗候选靶标。SjMRLC同日本血吸虫重要宿主中的同源序列在进化上属于不同的分支,SjMRLC含有1个EF-hand Ca2+结合结构域,提示其具有Ca2+结合功能;本研究构建了pGEX-4T-3/SjMRLC重组质粒,获得可溶性蛋白;SjMRLC基因在胞蚴、毛蚴、虫卵、尾蚴、童虫、雌虫、雄虫和合抱成虫中均有转录,且水平比较稳定。