RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种在动植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程，由与靶基因同源的dsRNA(double stranded RNA)所启动。快速发展的RNAi技术为恶性肿瘤机制的研究提供了有力工具，同时也推动了以该技术为基础的肿瘤治疗策略的研发进程。本研究拟从RNA干扰作为治疗手段的角度，以与肿瘤的发生发展密切相关的四个基因：表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factorreceptor，VEGFRl)、Delta样配体4(Delta-like ligand4,DLL4)为研究对象，探讨RNA干扰靶向治疗癌症的可行性。　　 本研究分为四部分，第一部分为基因特异性小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)筛选。使用本实验室自主开发的siRNA设计软件，针对每个基因设计合成三条siRNA，以阳离子脂质体LipofectamineTM2000作转染试剂，将siRNA转染细胞，采用Real time RT－PCR和Western blot分别检测siRNA在mRNA水平和蛋白水平对靶基因的沉默效果，并对每个基因沉默效果最好的siRNA做浓度梯度的沉默效果检测。筛选结果显示，EGFR siRNA_1、VEGF siRNA_3、VEGFR1siRNA_2、DLL4 siRNA_3对目的基因具有高效特异的干扰作用。　　 第二部分是从体外培养细胞水平，检测siRNA特异诱导基因沉默后，对肿瘤细胞生物学特性的影响。采用MTT法和荧光素酶报告基因法检测siRNA单独转染及联合转染后对细胞增殖的影响，用流式细胞仪和AnnexinV－FITC/PI双染法检测siRNA沉默基因后对细胞凋亡的影响。结果显示，与空白对照组和Notarget siRNA转染组相比，基因特异性siRNA转染组的细胞增殖活性均有不同程度的降低，而细胞凋亡率均有不同程度的增加，通过siRNA联合沉默实验发现，VEGF siRNA_3与DLL4 siRNA_3联合转染时对Hela-luc细胞的增殖有明显的抑制作用，其抑制率大于两条siRNA单独转染时的抑制率。因此，这些蛋白在体外培养的肿痛细胞中发挥着促增殖和抗凋亡作用，为进一步的动物实验奠定了基础。　　 第三部分为生物发光的肿瘤动物模型的建立。用脂质体包裹带有neo抗性基因及荧光素酶报告基因(luciferase)的真核表达质粒pGL4.17[luc2/neo]，体外转染人肺腺癌细胞株A549，通过G418抗性筛选获得有抗性的单克隆细胞株，然后参考体外生长曲线和荧光值测定结果，选择两个单克隆进行BALB/c裸鼠皮下移植瘤和SCID小鼠尾静脉移植瘤实验，通过活体动物体内光学成像系统，筛选出一个能够用于建立裸鼠皮下移植瘤及SCID小鼠尾静脉移植瘤模型的稳定表达荧光素酶的肺腺癌细胞株单克隆。结果显示，经过体内外反复筛选获得的A549－lucclone2，其裸鼠皮下移植瘤模型及SCID小鼠尾静脉移植瘤模型都具有生长稳定、直观性好、灵敏度高等特点，为下一步的动物实验提供了一个直观、快捷、方便和灵敏的活体模型，也为肺癌生长机制及抗肺癌药物的研究提供了一个理想的动物模型。　　 第四部分是siRNA靶向基因沉默对裸鼠皮下移植瘤生长的作用研究。利用前期筛选到的稳定表达荧光素酶报告基因的人肺腺癌细胞株A549-luc clone2建立裸鼠皮下移植瘤模型，采用活体动物体内光学成像系统实时检测移植瘤的生长情况，通过比较空白对照组、Notarget siRNA对照组并UEGFR siRNA治疗组之间的移植瘤荧光值，来反映移植瘤大小的差异。结果显示，EGFR siRNA治疗组移植瘤荧光值比空白对照组和Notarget siRNA对照组增加缓慢，移植瘤的生长速度也较空白对照组和Notarget siRNA对照组明显变慢，说明干扰EGFR基因表达对肺癌皮下移植瘤的生长具有明显的抑制作用。　　 总之，本文在体外细胞水平通过RNAi技术验证了EGFR、VEGF、VEGFR1、DLL4四个基因是肿瘤治疗的理想靶点，并通过活体动物体内光学成像系统实时监测，发现siRNA靶向EGFR基因沉默后能够抑制肺癌皮下移植瘤的生长，显示出了良好的治疗效果，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路和理想的研究平台。