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热预处理、缺血预处理、低氧预处理以及药物预处理的细胞保护作用已在心肌细胞、内皮细胞、神经细胞等不同类型的细胞上得到证实，内源性保护蛋白如热休克蛋白70（70-kD heat shock protein，HSP70）的诱导表达被证明是预处理产生细胞保护作用的关键。78-kD葡萄糖调节蛋白（78-kD glucose-reguIated protein，GRP78）是内质网分子伴侣，属HSP70家族。低氧、氧化应激、葡萄糖耗竭等多种应激刺激均可上调GRP78表达，GRP78水平升高可增强细胞在应激状态下的生存能力，具有细胞保护作用，但GRP78诱导表达在预处理中的作用尚不明确。最近Hayashi首次报道大鼠脑缺血预处理可诱导GRP78蛋白表达，对神经细胞延迟性缺血损伤产生保护作用。基于GRP78蛋白的可诱导性和细胞保护特性，我们假设GRP78的诱导表达可能是多种预处理产生细胞保护的共同机制。本研究试图在培养的乳鼠心肌细胞，观察低氧预处理和内皮素-1预处理对GRP78蛋白表达的影响及其对心肌细胞低氧损伤的保护效应，用Western blot检测GRP78蛋白水平，以已知介导多种预处理保护效应的内源性保护蛋白HSP70为阳性对照，分别将GRP78反义寡核苷酸和编码GRP78基因的重组腺病毒导入原代培养的乳鼠心肌细胞，以期降低和升高心肌细胞GRP78蛋白水平，进一步研究GRP78在多种预处理保护效应中的作用。 一、材料和方法 1．心肌细胞低氧损伤的模型：实验所用细胞均为原代培养乳鼠心肌细胞。培养的心肌细胞置于3％O2-92％N2-5％ CO2孵箱中、37℃孵育12h制备低氧损伤模型，以细胞上清液LDH活性反映细胞损伤程度、MTT反映心肌细胞活力，上清液SOD活性、MDA含量作为脂质过氧化损伤指标。以含1mM低亚硫酸钠（Na2S2O4）并持续通入95％N2-5％CO2混合气饱和的DMEM溶液为低氧液灌流心肌细胞，用Ca2+荧光探针Fluo-3／AM负载细胞，激光共聚焦显微镜下检测低氧前后心肌细胞[Ca2+]i荧光强度变化及ET-1预处理的影响。 2．心肌细胞低氧预处理：将心肌细胞培养液更换为无糖DMEM，预先充灌95％N2-5％CO2混合气15min以上，放入95％ N2-5％ CO2低氧小室中孵育30 min，然博士学位论文囱鲤邀鱼里自旦业2尽分导心肌细胞低氧及ET-l预处理保护作用的研究摘要后换以新鲜OMEM溶液，在95%ai卜5%COZ孵箱中恢复24h，随后给予3%O:-92%NZ一5%COZ低氧孵育1 Zh.对照组换以无糖OMEM培养液后在95%air一5%COZ孵箱中孵育30 min，然后再换以新鲜OMEM溶液，在95%ai卜5%COZ孵箱中孵育至实验结束。 3.心肌细胞E下1预处理:分别以0.01、0.1、InmollL ET-1孵育细胞30 min，新鲜OMEM洗1次，换新鲜OMEM溶液后心肌细胞在5%COZ孵箱中恢复24h，再放入3%。2一92%N2-5%COZ孵箱中、37℃低氧孵育，2h，观察ET-，预处理保护效应.E下，预处理对低氧心肌细胞[c扩场变化的影响，采用上述三种浓度E下1灌流细胞smin、新鲜OMEM冲洗10min为一次，重复三次，然后灌流低氧液进行低氧损伤。 4.HSp70、GRp78蛋白的检测:以Western blot方法检测低氧及E下1预处理和随后长时间低氧对心肌细胞HSP70、GRp78蛋白水平的影响. 5 .GRp78反义脱氧寡核普酸（AS.OON）的应用:合成硫代修饰的大鼠GRP78mRNA反义脱氧寡核普酸（AS一ODN）、正义序列（Sense一ODN）和随机序列（Scrambled一OON），在E下1预处理前24h加入培养液中转染心肌细胞，其终浓度为1林M，观察AS一OON对预处理保护效应及其对GRp78、HSp70蛋白表达的影响。并在AS一OON 51一端以荧光素队M标记，观察AS一OON在心肌细胞内的分布。 6.编码GRP78 cONA重组珠病毒的构建与应用:将人的GRP78全长cONA插入穿梭载体pOC316中，与复制缺陷型腺病毒（Ads）在293细胞中进行同源重组，经pcR鉴定重组腺病毒.GRP78重组腺病毒感染原代涪养的乳鼠心肌细胞，以表达绿色荧光蛋白（GFP）腺病毒作为报告基因和病毒载体对照，病毒感染复数（multiP“晰esofinfe比on，MOI）分别为0、 12.5、25、50和100Pfu加11，感染时l’q分别为24、48和72h，在荧光显徽镜下检喇腺病毒感染效率，用叭阳stem以ot检汉明GR尸78蛋白过表达水平，并观察GRP78过表达对心肌细胞低草峨员伤的保护作用。二、主要结果1.低氧预处理对培招L脚讼肌细胞延返性低氧领伤的影响（1）常氧培养3天的乳鼠心肌细胞呈自发性地同步化收缩，节律规则、频率约为80一120次份（beate Permin，bPm）.低氧30m!n后即刻观察到细胞收缩幅度明显减小、频率减慢，约为50一60 bpm;低氧12h后，大部分细胞已停止收缩，少数博士学位论文内质网驻留蛋白GRP78介导心肌细胞低氧及ET-1预处理保护作用的研究摘要细胞虽有收缩活动，但频率不超过20 bPm，胞浆中出现暗色小颗粒。（2）低氧组心肌细胞培养液上清中LO日漏出和MOA含量较常氧对照组明显升高，而500活性和细胞活力却明显降低.低氧组LO日、MOA分别为50.8士3.4UIL和1.88士0.12 nmoUL明显高于常氧对照组的27.5土1.9 UIL和0.98士0.11 nmol儿;SOD为1 5.7土4.IUlml明显低于常氧对照组的33.6士2.SUlml（n二8，P<0.01）:细胞活力为常氧组的61 .8士3.3%.预处理+低氧组，其LOH活性和MOA含量分别为41 .8士2.7U儿和1 .45土0.，nm