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免疫逃逸(immune escape)在肿瘤的发生、发展过程中有着重要的作用,其机制复杂,涉及肿瘤和宿主两方面。从肿瘤角度来说,一方面,肿瘤抗原的缺失、MHC分子的改变、共刺激分子的缺乏等都可以使肿瘤免受宿主免疫细胞的识别,从而逃脱抗肿瘤免疫反应;另一方面,肿瘤也可以通过“Fas反击机制”、免疫抑制性分子的分泌等机制主动影响抗肿瘤免疫细胞的增殖活化和功能。3β-羟基齐墩果-12-烯-27-羧酸(3β-hydroxyolean-12-en-27-oic acid,ATA)、3β,6β-二羟基齐墩果-12-烯-27-羧酸(3β,6β-dihydroxyolean-12-en-27-oic acid,ATB)和3β-羟基乌苏-12-烯-27-羧酸(3β-hydroxyur-12-en-27-oic acid,ATC)系虎耳草科Saxifragaceae植物落新妇Astilbechinese(Maxim.)Franch.et Say.的干燥根茎中分离得到的抗肿瘤活性三萜化合物,能显著抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡,同时具有增强机体免疫功能的作用,而其在肿瘤免疫逃逸机制方面的研究尚未见报道。本研究选择具有免疫抑制作用的人红白血病K562细胞和小鼠成纤维瘤L929细胞,通过检测3个化合物处理前后肿瘤细胞对免疫功能的影响及其免疫抑制分子mRNA表达的变化,从逆转肿瘤免疫抑制的角度探讨这些化合物的抗肿瘤免疫作用机制。
1.K562和L929细胞的免疫抑制作用研究
MTT法测定K562和L929细胞不同培养时间的培养上清对小鼠脾细胞增殖反应和自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响。结果表明: K562和L929细胞培养不同时间的培养上清对Con A和LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应,以及NK细胞杀伤活性均呈抑制作用,且随着培养时间的延长,抑制率逐渐升高,证实K562和L929细胞培养上清具有免疫抑制作用。
2.ATA、ATB和ATC对K562和L929肿瘤细胞免疫抑制作用的影响
MTT法检测ATA、ATB和ATC处理K562和L929肿瘤细胞再培养上清对小鼠脾细胞增殖反应和NK细胞杀伤活性影响。结果显示:ATA、ATB和ATC处理K562和L929细胞再培养上清对Con A和LPS诱导的脾细胞增殖反应以及NK细胞杀伤活性的抑制作用均显著低于单纯K562和L929细胞培养上清,说明ATA、ATB和ATC可逆转K562和L929细胞对小鼠脾细胞增殖反应和NK杀伤活性的抑制作用。
3.ATA、ATB和ATC对K562和L929细胞TGF-β1和VEGF基因表达的影响
K562和L929细胞经ATA、ATB和ATC作用48小时后,其转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor,VEGF)mRNA表达水平均显著低于未处理的对照细胞。表明ATA、ATB、ATC能下调K562和L929细胞TGF-β1和VEGF mRNA表达。
4.ATA、ATB和ATC处理K562和L929细胞对小鼠脾细胞分泌细胞因子的影响
采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定ATA、ATB和ATC处理K562和L929细胞再培养上清对小鼠脾细胞分泌白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ干扰(Interferon-γ,IFN-γ)能力的影响。结果显示:小鼠脾细胞与K562和L929细胞培养上清共孵育48h后,其上清中TNF-a和IFN-γ含量显著降低,而IL-4水平显著提高,说明K562和L929细胞能抑制Th1型细胞因子产生,促进Th2型细胞因子分泌。K562和L929细胞经ATA、ATB和ATC处理后,其再培养上清对小鼠脾细胞分泌TNF-a和IFN-γ的抑制作用,以及对IL-4产生的促进作用均较单纯K562和L929培养上清降低。说明ATA、ATB和ATC均能逆转K562和L929细胞促进小鼠脾细胞分泌Th2型细胞因子,以及抑制分泌Th1型细胞因子的作用。
5.ATA、ATB和ATC处理K562和L929细胞对小鼠脾细胞细胞因子基因表达的影响
采用RT-PCR方法检测经3种化合物作用后的K562和L929细胞再培养上清对小鼠脾细胞细胞因子基因表达的影响。结果表明:与单纯肿瘤培养上清对照比较,ATA、ATB和ATC处理K562和L929细胞再培养上清均能促进小鼠脾细胞IFN-γ、TNF-α和IL-2 mRNA表达,ATB和ATC处理K562和L929细胞再培养上清则能显著抑制小鼠脾细胞IL-10 mRNA表达。同时,ATA处理L929细胞再培养上清刺激的小鼠脾细胞IL-10 mRNA表达水平也显著低于单纯L929培养上清,而ATA处理K562肿瘤细胞再培养上清共孵育小鼠脾细胞IL-10 mRNA表达水平则显著高亍单纯K562培养上清。说明ATA、ATB和ATC均能拮抗K562和L929细胞对小鼠脾细胞Th1型细胞因子基因表达抑制作用,ATB和ATC也能下调K562和L929细胞对小鼠脾细胞IL-10基因表达的促进作用。ATA对K562和L929细胞促进小鼠脾细胞Ⅱ-10基因表达作用的影响,随肿瘤细胞类型不同有一定的差异。