几种抗菌消炎植物内生放线菌的分离及其抗菌代谢产物合成潜能研究

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放线菌一直是新药和新药先导化合物的重要来源,药用植物内生放线菌由于其特殊的生境及在长期进化过程中具有和宿主植物产生相同或者相近化合物的能力,成为研究的热点。本研究以成都、昆明、重庆、厦门和保定等地区的14种具有抗菌消炎功效的药用植物为实验材料,采用五种培养基进行内生放线菌的分离,共得到150株内生放线菌。根据菌株的分离来源、菌落形态和培养特征,选择了50株内生放线菌,通过抗菌活性检测及次级代谢产物合成基因(PKS-I、PKS-II和NRPS)的扩增、测序及分析来综合评价其抗菌代谢产物合成潜能;并对获得的活性菌株进行16S rDNA系统发育分析,进而确定活性菌株的物种多样性。采用A、B、C、D、E 5种不同的发酵培养基对50株内生放线菌进行发酵培养,发酵液用甲醇抽提浓缩后溶于1 m L 10%的DMSO中,得到250种发酵提取液,并采用15种病原指示菌进行抑菌活性实验。研究结果表明,50株供试内生放线菌中有48株对至少一种病原指示菌表现出抑制作用,有9株对六种以上病原指示菌具有抑菌作用,且不同发酵培养基对活性次级代谢产物的产生有重要的影响。对50株供试内生放线菌进行次级代谢产物合成基因(PKS-I、PKS-II和NRPS)的扩增、测序及分析,结果表明,4株菌具有PKS-I(8.0%)基因,24株菌具有PKS-II(48.0%)基因,4株菌(8.0%)具有NRPS基因,其中3株菌(6.0%)同时具有PKS-I和PKS-II基因;3株菌(6.0%)同时具有PKS-II和NRPS基因。序列分析结果表明,部分菌株的次级代谢产物合成基因和最近似序列的相似性较低,如菌株190580和菌株190600具有的PKS-I基因与Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491的PKS基因(X86780)最相近,相似性均为79%;菌株181101具有的PKS-I基因与Streptomyces sp.UNSW 094300的PKS基因(DQ020253)最相近,相似性为82%;菌株EA36具有的PKS-I基因与Streptomyces ambofaciens ATCC 23877基因组中(CP012382)的PKS基因最相近,相似性为86%;菌株EA33和菌株TJ24具有的PKS-II基因与Micromonospora aurantiaca S97的PKS基因(KJ094408)最相近,相似性分别为80%和86%;菌株EA34具有的PKS-II基因与Nocardiopsis alba S78-1的PKS基因(JX008012)最相近,相似性为86%;菌株181101具有的PKS-II基因与Streptomyces sp.FXJ7.388的PKS基因(HQ698848)最相近,相似性为84%;菌株190600具有的PKS-II基因与Streptomyces venezuelae ATCC15439基因组(CP013129)中的PKS基因最相近,相似性为88%;菌株TJ39具有的NRPS基因与Amycolatopsis sp.AAL24的NRPS基因(AY271636)最相近,相似性为75%;表明这些菌株含有的PKS基因和NRPS基因具有新颖的基因特征,值得后续进一步研究。对实验获得的49株具有抗菌活性或含有次级代谢产物合成基因的活性菌株进行16S rDNA扩增及测序,将所得的序列与Ez Biocloud中已知序列进行同源性比对,并进行系统发育分析,结果表明,49株活性菌株中,36株属于链霉菌属(Streptomyce),7株属于拟诺卡氏菌属(Nocardioides),5株属于小单孢菌属(Micromonospora),1株属于糖霉菌属(Glylomyces)。本研究通过抑菌活性检测和次级代谢产物合成基因扩增、测序及分析表明,抗菌消炎植物中的内生放线菌具有较好的抑菌活性,且不同发酵培养基对活性次级代谢产物的产生有重要的影响,这为今后采用多种培养基进行多样化发酵来挖掘内生放线菌活性次级代谢产物奠定了理论基础;部分供试菌株含有的次级代谢产物合成基因具有新颖的基因特征,为定向发掘新型聚酮类化合物和非核糖体肽类化合物积累了基因资源。
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