目的:血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由各种脑血管疾病导致的获得性、持续性智能障碍综合征,以学习、记忆功能损害为主要症状,可伴有语言、运动、视空间及人格障碍。随着社会人口日益老龄化和脑血管病后生存率的提高,由脑血管病造成的精神及智能损害日益突出,给社会和家庭带来沉重负担。因此探讨其可能的发病机制,制定合理的治疗方案已成为当前医学界的紧迫任务之一。近年研究显示:谷氨酸的兴奋毒性参与了血管性痴呆的病理机制。因此,减轻兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAA)的毒性作用,对于减轻缺血性脑损伤及其继发的学习与记忆障碍,具有极为重要的意义。谷氨酸转运体(excitator aminoacid transporters, EAATs)作为清除兴奋性氨基酸的主要物质,在全脑缺血的发生机制和治疗中发挥了重要作用。脑缺血时,细胞外液谷氨酸浓度持续大量升高,过度激活谷氨酸受体,导致Ca2+大量内流,细胞内Ca2+超载可激活中性蛋白酶Calpain,使其对细胞酶产生过度降解,引起细胞结构与功能异常及细胞死亡。细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cyclin dependent kinase 5, Cdk5)参与突触小泡循环、离子通道和细胞内信号转导通路的调节,在突触可塑性、学习与记忆过程中发挥关键作用。Cdk5的激动亚基p35也是Calpain的作用底物之一,病理条件下,Calpain可使p35蛋白降解成p25蛋白,后者使Cdk5激酶活性失调,导致包括凋亡、兴奋毒性等多种形式的细胞死亡。由活性氧(reactive oxygen species, ROS)引起的氧化损伤是导致认知功能障碍的重要原因。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)是评价氧化和抗氧化程度的重要指标。神经元内的氧化损伤和其他危害可引起Calpain介导的p35向p25的裂解。另外, Cdk5对自由基的产生具有调节作用。已有证据表明,在缺血、缺氧等条件下,自由基引起的氧化损伤参与了线粒体破坏、细胞坏死和凋亡等过程。目前有关EAATs、Calpain-Cdk5和活性氧通路在VD发生中的作用尚鲜有报道。盐酸多奈哌齐是胆碱酯酶抑制剂,可选择性抑制中枢神经系统中乙酰胆碱(Acetylcholine, Ach)的降解,增加神经细胞突触间隙Ach的浓度,提高记忆脑区的神经传导功能,从而改善大脑学习和记忆能力。有资料表明,多奈哌齐可增加VD患者受损脑区局部脑血流量,激活细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinases, ERK)的表达,降低海马神经元N-甲基-D-天门冬氨酸(N - methyl - D - aspartate receptor, NMDA)受体亚单位R1(NMDAR1, NR1)的表达,通过影响p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)的mRNA表达而改善学习和记忆功能,提示该药除发挥胆碱酯酶抑制剂的作用外,还通过多通道、多靶点参与学习和记忆功能的调节。但该药对EAATs和Calpain-Cdk5/p25通路以及ROS在VD中的作用尚未见报道。基于此,本文通过探讨EAATs和钙信号转导机制,观察该药治疗VD的效果并探讨其作用机制。方法:1采用双侧颈总动脉反复三次缺血-再灌注方法,制备小鼠VD模型,并设立假手术组和药物组(盐酸多奈哌齐);通过跳台试验和水迷宫试验进行学习和记忆成绩测试,HE染色观察海马组织病理变化。2采用免疫组化方法测定海马CA1区神经细胞膜上EAAT1和EAAT2的表达。3免疫组化方法测定海马CA1区神经元内Calpain I的表达。4反转录-聚合酶链反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)和Western-blot方法测定小鼠海马组织Cdk5的mRNA表达和蛋白表达,Western-blot方法测定各组小鼠海马组织p25表达。5紫外分光光度法测定海马神经元SOD活性和MDA含量。结果:1 VD小鼠模型的行为学评价和海马病理学特征1.1跳台试验学习成绩模型组术后第29d,43d和57d的反应时间分别是(120.46±30.25),(133.16±29.77)和(121.05±31.43),较假手术组的(29.38±3.76),(28.33±4.28)和(28.72±2.67)明显延长(P<0.05);多奈哌齐治疗组的反应时间分别是(48.12±11.23),(56.12±12.44)和(42.17±11.26),较模型组显著缩短(P<0.05)。模型组术后第29d,43d和57d的错误次数分别是(3.88±1.29),(4.38±1.13)和(3.14±1.29),假手术组分别是(1.96±0.46),(2.16±0.43)和(1.58±0.63),模型组错误次数较假手术组显著增多(P<0.05);多奈哌齐治疗组的错误次数分别是(2.27±0.64),(2.86±0.87)和(1.96±0.78),较模型组显著减少(P<0.05),与假手术组无明显差异(P>0.05)。1.2跳台试验记忆成绩术后第30d,44d和58d模型组的潜伏时间分别是(79.97±26.38),(80.78±26.12)和(79.87±20.17),较假手术组的(195.78±36.55),(186.78±36.21)和(178.26±35.23)均明显缩短(P<0.05),多奈哌齐治疗组的潜伏时间分别是(156.13±31.25),(161.22±33.15)和(129.58±22.43),较模型组显著延长(P<0.05);模型组术后第30d、44d和58d错误次数分别是(4.14±1.25),(4.04±0.98)和(3.98±1.14),假手术组分别是(1.93±1.01),(1.91±0.56)和(1.76±1.06),模型组错误次数较假手术组显著增多(P<0.05),多奈哌齐治疗组的错误次数分别是(2.56±1.08),(2.74±0.87)和(1.89±0.86),较模型组显著减少(P<0.05);药物组与假手术组之间无明显差别(P>0.05)。1.3水迷宫试验学习成绩术后第29d、43d和57d模型组小鼠游完全程时间分别为(124.33±53.22)、(116.21±50.31)和(119.31±55.41) ,较假手术组的(66.32±51.61)、(61.63±38.86)和(65.73±51.96)均明显延长(P<0.05),多奈哌齐治疗组小鼠游完全程的时间分别是(80.56±53.28)、(76.43±43.86)和(77.49±48.86),较模型组显著缩短(P<0.05);模型组术后第29d、43d和57d的错误次数分别是(11.68±1.36)、(15.76±1.68)和(13.78±1.77),假手术组分别是(5.76±1.55)、(5.65±1.28)和(5.85±1.39),模型组错误次数较假手术组显著增多(P<0.05),多奈哌齐治疗组的错误次数分别是(7.48±1.67)、(7.38±1.34)和(7.38±1.49),较模型组显著减少(P<0.05);提示药物组的学习成绩得到改善;并且与假手术组相比无明显差别(P>0.05)。1.4水迷宫试验记忆成绩术后第30d、44d和58d模型组小鼠游完全程时间分别为(111.58±48.32)、(109.77±51.28)和(111.32±58.38) ,较假手术组的(51.23±45.75)、(49.34±36.36)和(49.56±40.33)均明显延长(P<0.05),多奈哌齐治疗组小鼠游完全程的时间分别是(76.29±41.27)、(66.27±40.86)和(57.27±40.11),分别较模型组显著缩短(P<0.05);模型组术后第30d、44d和58d的错误次数分别是(11.69±2.34)、(14.65±1.39)和(14.95±2.19),假手术组分别是(5.31±1.22)、(5.35±1.04)和(5.68±1.13),模型组错误次数较假手术组显著增多(P<0.05),多奈哌齐治疗组的错误次数分别是(6.33±1.46)、(7.01±1.26)和(7.07±1.35),较模型组显著减少(P<0.05);提示药物组的记忆成绩得到改善;并且与假手术组相比无明显差别(P>0.05)。1.5 HE染色显示海马CA1区病理变化(1)假手术组:HE染色示各组小鼠海马CA1区轮廓清楚、锥体细胞为3～5层,数量丰富,呈圆形或椭圆形,排列规则致密,细胞核圆而大,核仁清晰,染色质丰富,神经纤维密集。术后4、6、8周各组单位面积正常神经元计数分别为(101.58±15.32)、(108.24±11.33)和(101.24±12.26)。(2)模型组:各组小鼠海马CA1区的锥体细胞层次减少,排列松散,细胞数目减少,细胞核体积变小,结构不清,呈核固缩表现,神经纤维排列紊乱。术后4周、6周和8周时各组单位面积内正常神经元计数分别为(65.33±19.28)、(21.23±3.12)和( 50.52±11.28),较假手术组均显著降低(P<0.05),其中以术后6周损害最严重,绝大部分神经元死亡,仅有少量细胞存活,正常神经元计数较模型组术后4、8周时也显著减少(P<0.05)。(3)治疗组:术后4周和8周时,小鼠海马CA1区锥体细胞排列较整齐,层次较清楚;无明显核固缩现象。正常神经元计数分别是(88.22±19.88)和(83.36±12.21),较模型组显著增高(P<0.05),与假手术组相比无明显差别(P>0.05)。术后6周小鼠海马组织CA1区锥体细胞排列较整齐,层次较清楚;仍有部分核固缩现象。正常神经元计数为(46.38±5.17),较模型组显著增高(P<0.05),但仍显著低于假手术组(P<0.05)。上述结果表明,海马是影响学习和记忆功能的重要结构,脑缺血-再灌注可引起VD的发生,伴海马神经元严重受损,以术后6周最明显。盐酸多奈哌齐可减轻VD小鼠的病理改变和学习与记忆能力。2 VD小鼠海马CA1区EAATs表达及盐酸多奈哌齐的影响取出小鼠脑组织,经4 %多聚甲醛灌注固定后,石蜡包埋,冠状切片,进行免疫组化染色,观察EAAT1和EAAT2的平均光密度值(mean optical density,OD)表达。结果显示:假手术组在术后4周、6周和8周时小鼠海马CA1区细胞膜上EAAT1表达的OD值分别是(0.030±0.003)、(0.031±0.002)和(0.030±0.003);模型组细胞膜上EAAT1表达的OD值分别是(0.099±0.009)、(0.122±0.009)和(0.112±0.010),较假手术组均显著升高(P<0.05),尤以术后6周时增高明显;盐酸多奈哌齐治疗组在上述三个时间点EAAT1表达的OD值分别是(0.047±0.004)、(0.046±0.003)和(0.044±0.004),显著低于模型组(P<0.05),与假手术组无明显差异(P>0.05);术后4、6、8周假手术组海马CA1区细胞膜上EAAT2表达的平均OD值分别是(0.031±0.003)、(0.030±0.002)和(0.030±0.003);模型组的平均OD值为(0.098±0.008)、(0.113±0.008)和(0.101±0.009),较假手术组均显著增高(P<0.05),药物组EAAT2表达的平均OD值分别是(0.039±0.003)、(0.047±0.005)和(0.042±0.004),均较模型组显著降低(P<0.05),与假手术组无显著差异(P>0.05)。提示EAAT1和EAAT2参与了VD的发生,多奈哌齐改善学习和记忆的能力可能与其降低EAAT1和EAAT2表达有关。3 VD小鼠海马CA1区Calpain I的表达及盐酸多奈哌齐的影响小鼠脑组织经4 %多聚甲醛灌注固定后,石蜡包埋,冠状切片,行免疫组化染色,观察海马CA1区Calpain I的OD值。结果显示:假手术组术后4周、6周和8周时小鼠海马CA1区细胞层次清晰,胞浆内仅有微量Calpain I的表达(分别是0.030±0.003、0.031±0.003和0.029±0.003);模型组术后4周、6周和8周时海马CA1区神经细胞结构松散,神经元胞浆内Calpain I的平均OD值分别是(0.099±0.009)、(0.121±0.010)和(0.115±0.010)较假手术组均显著增高(P<0.05),尤以术后6周时增高明显;盐酸多奈哌齐治疗组在上述三个时间点Calpain I的表达分别是(0.040±0.004)、(0.044±0.004)和(0.042±0.003),均较模型组显著降低(P<0.05),与假手术组接近(P>0.05)。说明脑缺血-再灌注可引起神经元内Ca2+超载,激活Calpain I,出现持续高表达,引起神经元损害和VD的发生。盐酸多奈哌齐可能通过降低Calpain I的表达而发挥神经保护作用。4 VD小鼠海马Cdk5的蛋白表达和mRNA表达及盐酸多奈哌齐的影响4.1 Western-blot显示海马组织Cdk5的蛋白表达脑缺血-再灌注后4周、6周和8周时模型组海马组织Cdk5的蛋白表达为(0.54±0.05)、(0.73±0.07)和(0.70±0.06) ,分别较假手术组的(0.23±0.02)、(0.31±0.02)和(0.33±0.02)显著增高(P<0.05),提示Cdk5的蛋白表达在脑缺血-再灌注8周内呈持续性增高;盐酸多奈哌齐治疗组在上述三个时间点Cdk5蛋白表达分别为(0.28±0.02)、(0.33±0.03)和(0.38±0.02),均较模型组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2 RT-PCR检测Cdk5的mRNA表达术后4周、6周和8周时模型组海马组织Cdk5的mRNA表达分别为(0.80±0.07)、(0.91±0.08)和(0.92±0.08),分别较假手术组的(0.35±0.02)、(0.38±0.04)和(0.36±0.03)显著增高(P<0.05);盐酸多奈哌齐治疗组在上述三个时间点mRNA表达分别为(0.33±0.02)、(0.40±0.04)和(0.39±0.08),较模型组均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示,在脑缺血-再灌注后4周时海马组织Cdk5蛋白表达和mRNA表达均显著增高,且持续至术后8周仍未恢复,此与行为学改变和神经元损害基本一致,并与Cdk5的上游激活物Calpain I的表达相一致,提示Calpain I-Cdk5的异常增多参与了脑缺血后VD小鼠海马神经元的死亡,并可能与记忆损害相关。盐酸多奈哌齐可能通过降低Calpain I的表达和Cdk5的生成,进而改善学习和记忆能力。5 VD小鼠海马组织p25蛋白表达及盐酸多奈哌齐的影响Western-blot检测海马组织p25蛋白的表达水平:术后4周、6周和8周时模型组海马组织p25蛋白的表达分别为(0.44±0.04)、(0.51±0.04)和(0.55±0.06),分别较假手术组的(0.19±0.02)、(0.24±0.02)和(0.20±0.02)显著增高(P<0.05),提示p25蛋白表达在脑缺血-再灌注8周内呈持续性增高;盐酸多奈哌齐治疗组在上述三个时间点p25蛋白表达分别为(0.26±0.02)、(0.25±0.03)和(0.21±0.02),较模型组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。p25蛋白是Cdk5的异常激活因子,其显著增高提示Cdk5活性失调,是导致脑缺血-再灌注后神经元死亡的重要因素,盐酸多奈哌齐可能通过降低Calpain 1的表达而减少p35的裂解,使p25生成减少,缓解Cdk5的活性失调,从而减轻神经元死亡。6 VD小鼠海马组织SOD活性和MDA含量变化及盐酸多奈哌齐的影响6.1 SOD活性测定结果脑缺血-再灌注后4、6和8周时,模型组SOD活性分别是(7.17±1.66 U/mg*prot)、(7.07±1.43U/mg*prot)和(7.23±1.33U/mg*prot),分别高于假手术组的(3.10±0.46 U/mg*prot)、(3.22±0.52 U/mg*prot)和(3.19±0.40 U/mg*prot),差异有统计学意义(P<0.05);药物组术后4、6和8周的SOD活性分别为(4.39±0.38 U/mg*prot)、(4.88±0.47 U/mg*prot)和(4.76±0.55 U/mg*prot),显著低于模型组(P<0.05),与假手术组无明显差异(P>0.05)。6.2 MDA含量测定结果术后4、6和8周时,模型组MDA含量分别是(15.26±3.23 nmol/mg *prot)、(16.33±3.76 nmol/mg*prot)和(16.67±3.75 nmol/mg*prot),高于假手术组的(6.33±1.16nmol/mg*prot)、(6.87±1.06nmol/mg*prot)和(6.63±1.11 nmol/mg*prot),差异有统计学意义(P<0.05);药物组术后各模型组的MDA含量分别为(7.42±1.89nmol/mg*prot)、(8.32±1.68nmol/mg*prot)和(8.58±1.7 6nmol/mg*prot),显著低于模型组(P<0.05),与假手术组无差异(P>0.05)。本研究通过对脑缺血后MDA含量和SOD活性的检测发现氧化损伤参与了该病的发生。盐酸多奈哌齐可通过降低MDA含量和SOD活性而发挥神经保护作用。结论:1本实验成功建立了小鼠VD模型,经HE染色显示海马神经元受损严重,以缺血再灌注后6周时最明显,持续至术后8周仍未恢复正常。提示本模型能够基本模拟临床上VD的智能障碍,是比较理想的VD动物模型;盐酸多奈哌齐通过减轻小鼠海马病理损害而改善其学习和记忆能力,取得了相应的治疗效果。2 EAAT1和EAAT2作为对谷氨酸转运起决定作用的兴奋性氨基酸转运体,在脑缺血-再灌注后8周内小鼠海马出现持续性高表达,与神经元损伤和认知能力下降相一致,提示EAATs异常继而导致谷氨酸转运失调,及其后的Ca2+信号系统功能障碍可能是VD发生的重要因素。3 Calpain I是Ca2+信号通路的重要组成部分,在脑缺血-再灌注后8周内呈持续高表达,伴海马神经元受损,RT-PCR和Western-blot技术进一步证实海马组织Cdk5表达增加,其病理性激活因子p25的生成也相应增高,提示Calpain I-Cdk5/p25通路的表达增加参与了VD的发生。4 ROS的代表性物质SOD和MDA参与了VD的发生,提示氧化应激在脑缺血-再灌注后痴呆的发生中扮演了重要角色。5盐酸多奈哌齐可以通过减少Calpain I-Cdk5/p25通路的表达、EAAT1和EAAT2的表达和ROS的产生而改善VD的临床症状。