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研究背景近年来,随着人口增长、老龄化及社会人口变迁等,癌症的发病人数和死亡人数逐渐增加,肺癌已成为我国居民的首要死亡原因。肺癌按组织学分类,可以分为小细胞肺癌（small cell lung carcinoma,SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）,其中SCLC占肺癌的15%左右,NSCLC占85%左右。约3040%晚期肺癌患者发生骨转移,一旦发生骨转移后,类似于其他肿瘤骨转移,可发生病理性骨折、脊髓压缩、高钙血症和骨性疼痛等等一系列骨相关事件（skeletal-related events,SREs）;肺癌患者发生骨转移,特别是SREs将严重降低其生活质量和生存期。肿瘤骨转移的过程可以简要的概括为肿瘤细胞的转移定植和克隆生长两个阶段。肿瘤骨转移的发生与肿瘤细胞自身基质环境的选择和骨微环境中niche的准备相关。研究发现CXCL12-CXCR4轴在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。在乳腺癌的研究中发现肿瘤基质细胞通过分泌CXCL12选择CXCR4+细胞,决定肿瘤转移的器官特异性;研究发现骨转移NSCLC的CXCR4+细胞比例显著增高,阻断CXCL12-CXCR4轴,可以抑制NSCLC的转移,包括骨转移;在肺癌A549细胞系中,通过RNAi抑制CXCR4的表达,可抑制其转移特性。因此CXCL12-CXCR4参与NSCLC的（骨）转移过程。肿瘤转移后克隆生长需经历静止状态、形成微转移、发展为转移病灶三个过程。肿瘤细胞转移至骨后,肿瘤细胞对骨组织的影响主要表现为打破骨代谢内在的动态平衡,并导致一系列严重并发症;骨相关细胞及基质通过分泌一系列细胞因子,促进肿瘤生长,从而形成肿瘤-骨破坏的恶性循环。但肺癌骨转移的肿瘤细胞在何时开始打破骨代谢内在的动态平衡、诱导破骨细胞生成（osteoclastogenesis,OCG）,启动骨破坏不得而知。在乳腺癌骨转移机制研究中发现,VCAM-1在乳腺癌细胞骨转移后启动骨破坏的过程中发挥着重要作用。VCAM-1（vascular cell adhesion molecule 1,CD106）为跨膜免疫球蛋白家族,主要表达在受刺激后的血管内皮细胞上,蛋白酶水解后存在可溶性的VCAM-1,其主要受体整合素α4β1（very late antigen-4,VLA-4）在多种类型的造血系细胞中表达,包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等。在乳腺癌的研究中发现,VCAM-1在乳腺癌细胞中异常表达,参与肿瘤转移微环境中肿瘤-基质的相互作用,易于肿瘤转移至肺和骨组织;在肿瘤肺转移机制的研究中发现,肿瘤细胞粘附与肺血管后,激活内皮细胞表达VCAM-1,募集骨髓细胞,促进肿瘤细胞的存活及早期转移的发生;同时VCAM-1表达于部分NSCLC组织,及NSCLC患者血浆VCAM-1水平明显高于健康对照组、且与化疗敏感性和生存率相关,在骨髓瘤的研究中发现,骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞通过VCAM-1与α4β1介导的细胞间作用增强破骨细胞的活性而促进骨破坏。但VCAM-1在肺癌骨转移中的具体作用未见研究报道。因此,我们推测VCAM-1参与肺癌发生和转移过程,在肺癌转移骨破坏的启动过程中发挥重要作用。本实验拟通过体外构建CXCR4+NSCLC细胞株,模拟富CXCL12的肿瘤-骨微环境,研究CXCR4+NSCLC细胞与破骨细胞生成的关系,以及VCAM-1是否参与破骨细胞生成及其相关机制研究方法一、CXCR4在NSCLC骨转移组织和不同NSCLC细胞系中表达的检测1.免疫组化染色确定CXCR4在肺癌骨转移组织中的表达情况,TRAP检测OCs在NSCLC肿瘤-骨界面的生成情况。2.RT-PCR、Western Blot等方法检测CXCR4、CXCR7、CXCL12在肺癌A549、NCI-H1299、H1975细胞系的表达水平,筛选合适细胞系行下一步研究;二、CXCR4±NSCLC细胞系的构建与相关特性鉴定利用shRNA慢病毒构建CXCR4低表达的NCI-H1299细胞系,利用过表达慢病毒载体构建CXCR4高表达的H1975细胞系,并进行如下检测:1.RT-PCR及Western Blot检测慢病毒转染后NCI-H1299、H1975细胞系中CXCR4的表达水平;2.CCK-8方法检测CXCR4对NSCLC细胞增殖的影响;3.划痕实验和Transwell迁移实验检测CXCR4对NSCLC细胞迁移能力的影响。三、CXCR4+NSCLC细胞对破骨细胞生成的影响利用低剂量RANKL与NSCLC细胞条件培养基诱导小鼠单核细胞RAW264.7分化为破骨细胞,检测NSCLC细胞CXCL12-CXCR4轴在破骨细胞分化中的作用。主要检测方法:1.RT-PCR检测破骨细胞标志性基因TRAP、CK的相对表达量;2.利用破骨细胞特异TRAP染色检测破骨细胞分化成熟情况;3.加入CXCR4拮抗剂AMD3100,观察条件培养基对破骨细胞分化成熟的影响。四、CXCR4+NSCLC细胞促进破骨细胞生成的机制1.ELISA方法检测CM中相关促破骨细胞分化因子;2.RT-PCR及Western Blot检测相关基因在H1975细胞中的表达情况3.RT-PCR检测破骨细胞标志性基因TRAP、CK的相对表达量;4.利用破骨细胞特异TRAP染色检测破骨细胞分化成熟情况;5.加入ADAM17拮抗剂TAPI-1与TAPI-2,观察条件培养基对破骨细胞生成的影响及检测H1975细胞中ADAM17表达变化。实验结果一、CXCR4在NSCLC骨转移组织和不同NSCLC细胞系中表达1.CXCR4在NSCLC骨转移标本组织中存在表达,且骨破坏活跃区域表达量较高,其表达与OCs数量存在一定相关性。2.CXCR4在NCI-H1299中高表达,在H1975表达最低,CXCLl2在三个细胞系中均未检测到表达。二、CXCR4±NSCLC细胞系的构建与鉴定1.利用CXCR4A shRNA序列可有效建立稳定的CXCR4低表达NCI-H1299细胞系。RT-PCR、Western Blot结果显示,CXCR4A shRNA慢病毒感染并经过嘌呤霉素筛选后,NCI-H1299细胞中CXCR4的mRNA和蛋白表达水平明显下降,表明建立了稳定的CXCR4低表达细胞系。2.利用过表达慢病毒载体可有效构建稳定的CXCR4高表达H1975细胞系。RT-PCR、Western Blot结果显示,经CXCR4过表达慢病毒感染后,H1975细胞中CXCR4的mRNA和蛋白表达水平均明显升高,表明建立了稳定的CXCR4高表达细胞系。3.CXCR4影响NSCLC细胞的增殖CCK-8结果显示,抑制CXCR4表达可抑制NCI-H1299增殖,过表达CXCR4可促进H1975细胞增殖,CXCR4参与NSCLC细胞的增殖过程。4.CXCR4影响NSCLC细胞的增殖划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,抑制CXCR4表达可明显抑制NCI-H1299细胞的横向和纵向迁移能力,过表达CXCR4可增强H1975细胞的横向和纵向迁移能力,CXCR4参与NSCLC细胞的迁移过程。三、CXCR4+NSCLC细胞对破骨细胞生成的影响1.下调CXCR4表达抑制NCI-H1299细胞CM的促OCs生成作用NCI-H1299细胞CM可明显促进RAW264.7细胞TRAP、CK破骨细胞标志性基因的mRNA表达,TRAP染色及计数结果显示形成更多的破骨细胞;shRNA下调NCI-H1299细胞CXCR4表达后,其CM促进RAW264.7向OCs分化的能力受到抑制。2.上调CXCR4表达明显促进H1975细胞CM的促OCs生成作用H1975细胞CM可明显促进RAW264.7细胞TRAP、CK破骨细胞标志性基因的mRNA表达,TRAP染色及计数结果显示形成更多的破骨细胞;上调CXCR4在H1975细胞的表达后,其CM促进RAW264.7向OCs分化的能力进一步增强。3.AMD3100可抑制CXCL12-CXCR4轴介导的破骨细胞生成在制备H1975-OE细胞CM时,加入AMD3100,RT-PCR结果显示可明显降低RAW264.7细胞TRAP、CK破骨细胞标志性基因的mRNA表达;TRAP染色及计数结果显示形成较少的破骨细胞。四、CXCR4+NSCLC细胞促进破骨生成的机制1.VCAM-1、VEGF、MMP-9在CXCL12诱导的H1975-OE细胞高表达,sVCAM-1在H1975-OEOE CM异常高表达ELISA结果显示VCAM-1、VEGF、MMP-9在H1975-OE CM组均显著升高,其中VCAM-1异常升高;RT-PCR显示相同的趋势,但VCAM-1 mRNA增高不显著。2.CXCL12-CXCR4信号轴激活下游ADAM17的表达进一步查找sVCAM-1异常升高的原因,在加入CXCL12诱导的同时,加入广谱基质金属蛋白酶抑制剂TAPI-2或TAPI-1,RT-PCR、Western Blot、ELISA等结果显示:（1）ADAM17在H1975-OE细胞中高表达,加入AMD3100或TAPI-2后其相对表达量显著降低;（2）AMD3100或TAPI-2可显著降低H1975-OE细胞CM中的sVCAM-1、VEGF、MMP-9的表达量;（3）TAPI-1可显著降低ADAM17在H1975-OE细胞中的表达及H1975-OE细胞CM中sVCAM-1的表达。3.TAPI-1或TAPI-2可抑制CXCL12-CXCR4轴介导的破骨细胞生成在制备H1975-OE细胞CM时,加入TAPI-1或TAPI-2,RT-PCR结果显示其可明显降低RAW264.7细胞TRAP、CK破骨细胞标志性基因的mRNA表达;TRAP染色及计数结果也显示形成较少的破骨细胞。结论本实验检测了CXCR4在NSCLC肿瘤骨转移标本和不同NSCLC细胞系中的表达情况,转染形成了CXCR4高低表达的稳定细胞株,探讨了CXCL12-CXCR4信号轴激活对NSCLC细胞特性的影响、及其影响NSCLC细胞促进破骨细胞生成的初步机制。主要结论如下:1.CXCR4在NSCLC骨转移标本和不同NSCLC细胞株中表达,CXCR4的表达与OCs生成和骨破坏存在一定的相关性;2.CXCL12-CXCR4信号轴调节NSCLC细胞的增殖与迁移过程,影响NSCLC细胞的肿瘤特性;3.通过激活CXCL12-CXCR4信号轴,NSCLC细胞分泌系列细胞因子、特别是sVCAM-1促进破骨细胞生成,阻断CXCL12-CXCR4信号轴或抑制ADAM17蛋白表达,可抑制NSCLC细胞的促破骨细胞生成作用。综上,NSCLC细胞可通过CXCL12-CXCR4信号轴激活,分泌促破骨细胞生成因子,促进破骨细胞生成而形成骨转移破坏。