研究背景及目的:创面再上皮化包括表皮细胞迁移、增殖与分化。其中,表皮迁移是再上皮化的限速步骤,也是创面慢性不愈的关键环节,一直是创面愈合研究领域的焦点和热点。我们课题组前期研究发现,下调CD9促进表皮迁移,而CD9基因敲除小鼠中创面修复延迟,提示CD9在创面愈合中起关键作用。CD9是一类高度保守、完整的跨膜蛋白,由两个胞外域套环和较短的胞内末端以及四个跨膜结构域组成,对细胞迁移、运动和粘附均有重要作用。与其他细胞表面蛋白相比,CD9本身没有受体或激酶类功能,主要通过与其他跨膜分子,包括整合素、ADAMs和信号转导蛋白相互结合、作用,进而介导各种细胞效应和生理过程。然而,在表皮迁移过程中,CD9与其他跨膜分子相互作用的调控机制尚不清楚。我们之前的研究发现,下调CD9触发整合素αvβ5转化为αvβ6,是调控表皮迁移的关键步骤;然而,有关CD9和整合素αvβ5交互作用的功能区域尚未阐明。此外,CD9与整合蛋白α2β1或α3β1形成的跨膜蛋白复合物,并不参与表皮迁移。因此,CD9拟通过与其他非整合素跨膜蛋白分子相互作用进而调节表皮细胞迁移。ADAMs是一类具有脱落酶活性的跨膜蛋白家族,可特异性裂解释放各种蛋白底物,对炎症反应、创面修复和肿瘤发生有重要的影响。然而,只有ADAM17被认为是皮肤修复的关键因子,ADAM17通过调控炎症反应和促进损伤皮肤修复,被认为是抵御损伤的第一道防线。在体研究发现,ADAM17缺失的小鼠表型出生后不久便死亡,并有皮肤屏障缺陷,在急性创面损伤早期,表皮细胞中ADAM17被激活,促使表皮生长因子家族分子如HB-EGF,TGF-α和AREG大量裂解释放,表皮生长因子受体配体激活,促进表皮细胞迁移,从而显著提高创面愈合速度和愈合质量。进一步研究发现,HB-EGF和TGF-α对表皮迁移均有重要作用,而HB-EGF对创面再上皮化和加速伤口愈合的作用尤为突出。上述研究表明,ADAM17在表皮细胞迁移和创面再上皮化中起关键作用。然而,表皮细胞中ADAM17成熟或活化的机制尚未阐明。采用超分辨率显微镜观察发现,大多数四分子交联体蛋白家族分子（tetraspanins）与ADAMs可形成跨膜蛋白复合物。这为我们进一步探究CD9/ADAM17负调控表皮迁移的作用机制提供了重要的理论依据和结构基础。本研究提出“CD9通过负调节ADAM17脱落酶活性,进而促进EGF家族分子的成熟与胞外释放,是CD9调节表皮细胞迁移的重要机制”的科学假设,并通过系列实验予以论证,研究对深入揭示CD9参与创面表皮迁移的作用机理,深化对创面愈合发生机制的认识,具有重要意义。研究内容与方法:1.表皮细胞CD9和ADAM17的表达定位与相互作用关系采用免疫荧光双染,激光共聚焦观察C57小鼠皮肤表皮、原代表皮细胞和HaCaT（人表皮细胞株）细胞中CD9和ADAM17的表达和定位,免疫共沉淀进一步明确CD9和ADAM17的相互作用关系2.CD9对ADAM17表达和功能的影响及其与表皮细胞迁移的关系研究构建CD9高表达/低表达重组腺病毒载体,转染HaCaT细胞和C57原代表皮细胞,明确表皮细胞CD9对ADAM17表达、成熟和活化的影响;在此基础上,采用体外细胞划痕试验或运动性实验,观察抑制ADAM17活性（ADAM17抑制剂-TAPI-2预处理或siADAM17转染表皮细胞）对CD9负调控表皮迁移的影响3.CD9/ADAM17调节表皮迁移的下游信号机制抑制ADAM17活性,观察其对CD9低表达表皮细胞释放EGF家族分子和EGFR/MAPK（ERK、JNK和p38 kinase）磷酸化水平的影响,明确表皮细胞CD9对ADAM17活性的负调节作用及主要受调节的EGF家族分子与信号通路。4.CD9与ADAM17相互作用的功能结构域鉴定采用膜酵母双杂交系统（泛素化系统）鉴定金属蛋白酶ADAM17与CD9的互作结构域;在此基础上,构建互作结构域突变质粒,转染表皮细胞,免疫共沉淀检测其相互作用,分析ADAM17活性变化,以及对表皮迁移、运动的影响。结果:1.免疫荧光双染发现CD9与ADAM17共定位表达于表皮细胞膜上,蛋白免疫印迹提示CD9免疫沉淀均见与ADAM17成熟形态相对应的条带。2.下调CD9可使ADAM17脱落酶活性显著增强,上调CD9则使ADAM17脱落酶活性受抑;抑制ADAM17活性,使CD9低表达表皮细胞运动性显著降低以及创面愈合率的增强效应显著受抑。3.下调CD9显著促进AREG和HB-EGF的脱落释放,而抑制ADAM17活性,则CD9低表达表皮细胞中AREG与HB-EGF的释放水平大幅降低;中和释放的HB-EGF,则CD9低表达表皮细胞的运动速率显著降低、表皮创面愈合率降低达25%。4.下调CD9显著提高表皮细胞中EGFR、ERK和JNK的磷酸化水平,而si-ADAM17转染可使上述信号分子的磷酸化水平显著受抑;将外源性重组HB-EGF加入培养上清,可逆转si-ADAM17对CD9低表达表皮细胞EGFR和ERK磷酸化水平的抑制效应。5.酵母双杂交功能验证实验发现,在DDO平板上菌落正常生长,表明CD9诱饵质粒与ADAM17猎物质粒共转化实验成功,生长菌落显示蓝色,进一步表明PBt3-N-bait蛋白与post1-Nubal蛋白发生相互作用,激活了报告基因的表达。结论:综上所述,我们的研究表明,表皮细胞中CD9负调控ADAM17脱落酶活性和EGF家族分子（主要为HB-EGF）的裂解释放,进而影响EGFR/ERK信号通路激活,是CD9负调节表皮迁移的重要机制。CD9-LEL和ADAM17解聚素区是CD9与ADAM17相互作用的关键功能结构区,直接影响ADAM17的脱落酶活性。基于本研究发现,调控CD9/ADAM17轴以及下游EGF/EGFR/ERK信号通路,有利于促进急性和慢性创面愈合,是调控创面愈合具有潜在临床应用价值的新型靶点。