骨形态发生蛋白4调节人牙髓干细胞与脱细胞牙髓基质协同促进牙髓样再生研究

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目的:本实验研究人脱细胞牙髓基质(Decellularized Dental Pulp Extracellular Matrix,dECM)的结构和功能,探究骨形态发生蛋白4(Bone Morphogenetic Protein4,BMP4)能否与dECM共同调节人牙髓干细胞(Human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs)的牙髓样组织再生。方法:体外实验:收集18-22岁临床健康由于正畸或阻生需要拔除的人第三磨牙,改良组织块法培养hDPSCs并进行流式细胞术鉴定;用10%十二烷基硫酸钠(SDS)和Triton X-100制作dECM,H&E、DAPI染色,电子显微镜观察其结构;Cell Counting Kit-8分析细胞增殖生长曲线。使用重组腺病毒介导的BMP4与GFP转染hDPSCs;分别在dECM、dECM+三维(3D)Vitrogel生物支架中培养。检测不同时间点碱性磷酸酶活性(ALP),实时聚合酶链反应(RT-PCR)以评估骨/牙本质/血管生成标记相关基因表达。体内实验:BMP4转染hDPSCs并与dECM支架共培养,移植到裸鼠背部,4周后切除背部新生成组织,H&E染色分析以评估牙髓样组织的形成。结果:成功提取hDPSCs并完成流式细胞术鉴定;制作脱细胞牙髓细胞外基质,并于镜下确定无细胞核存在。CCK-8分析表明dECM可以支持hDPSCs的生长和增殖没有明显的细胞毒性。ALP染色结果显示BMP4+dECM+hDPSCs组染色均强于对照组。RT-PCR结果显示成骨(ALP/DMP1/OPN/DSPP/COL)和成血管(VEGF/OSM)基因的表达增加,体内实验结果显示裸鼠背部形成皮下肿块,H&E染色观察牙髓样组织形成。结论:dECM促进hDPSCs增殖,而BMP4与dECM协同促进hDPSCs体外成骨和成血管分化,体内形成牙髓样组织。
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