【摘 要】
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目的:血管钙化（Vascular calcification,VC）是导致慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患者心血管事件发生率和全因死亡率增高的独立危险因素,涉及血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的骨/软骨样转分化。近期研究发现,VSMCs来源的血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1（serum-and glucocor
【基金项目】
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国家自然科学基金（81570612）；
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目的:血管钙化（Vascular calcification,VC）是导致慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患者心血管事件发生率和全因死亡率增高的独立危险因素,涉及血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的骨/软骨样转分化。近期研究发现,VSMCs来源的血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1（serum-and glucocorticoid-inducible kinase 1,SGK1）可促进VSMCs骨/软骨样转分化和钙化。众所周知,巨噬细胞在VC过程中发挥着至关重要的作用,但具体机制尚不清楚。本研究通过体外培养小鼠巨噬细胞和主动脉平滑肌细胞（Mouse aortic smooth muscle cells,MAo SMCs）,明确巨噬细胞来源的SGK1在MAo SMCs骨/软骨样转分化过程中的关键作用及其信号转导机制。方法:IFN-γ+LPS干预巨噬细胞使其向M1极化,加入IL-4干预使其向M2极化,记为M0组、M1组、M2组,采用RT-qPCR、Western blot、细胞免疫荧光检测以上各组巨噬细胞中SGK1的表达。EMD638683药物抑制巨噬细胞中SGK1的表达记为M2-EMD组,收集上清液（M0-CM、M2-CM、M2-EMD-CM）与培养基1:1混合,孵育MAo SMCs,采用RT-qPCR、Western blot检测MAo SMCs标志物SM22α,骨/软骨样细胞标志物Runx2、ALPL的表达;采用茜素红染色实验评价MAo SMCs内钙沉积,钙定量试剂盒测定MAo SMCs内钙含量。RT-qPCR、Western blot、细胞免疫荧光检测M0组、M2组、M2-EMD组细胞中TGFβ1的表达,Elisa检测其上清中的表达。培养基孵育经外源性TGFβ1类似物干预过的MAo SMCs,收集M2-CM与培养基1:1混合孵育经TGFβ1Ⅰ型受体抑制剂（SB-431542）干预过的MAo SMCs,再次分别采用上述方法检测骨/软骨样细胞标志物、MAo SMCs标志物及细胞内钙沉积。结果:1.RT-qPCR、Western blot、免疫荧光检测显示,与M0型相比,SGK1在M2中高表达,在M1中低表达（P<0.05）。2.RT-qPCR、Western blot、免疫荧光检测显示,经M2-CM干预的MAo SMCs标志物（SM22α）表达降低,骨/软骨样标志物（Runx2、ALPL）表达增加（P<0.05）;茜素红染色实验结果显示,普通培养基条件下的MAo SMCs内未见橘红色钙沉积,成骨培养基条件下的MAo SMCs内均可见橘红色钙沉积,经M2-CM干预的MAo SMCs内较未受巨噬细胞上清液以及M0-CM干预的MAo SMCs内有更多的橘红色钙沉积;钙定量测定显示结果与上述茜素红染色实验结果一致。3.RT-qPCR、Western blot、免疫荧光检测显示,M2型巨噬细胞较M0型高表达TGFβ1;Elisa检测显示,M2型巨噬细胞上清液较M0型上清液高表达TGFβ1;EMD638683减弱了TGFβ1在M2型巨噬细胞及其上清液中的高表达。EMD638683和SB-431542减弱了M2-CM对MAo SMCs的上述作用:MAo SMCs标志物（SM22α）表达增加,骨/软骨样标志物（Runx2、ALPL）表达降低（P<0.05）,橘红色钙沉积减少,钙含量降低（P<0.05）。外源性TGFβ1类似物与M2-CM有相似的作用:MAo SMCs标志物（SM22α）表达降低,骨/软骨样标志物（Runx2、ALPL）表达升高（P<0.05）,橘红色钙沉积增多,钙含量升高（P<0.05）。结论:1.M2高表达SGK1,M1低表达SGK1（M0型巨噬细胞为对照组）;2.M2可诱导MAo SMCs骨/软骨样转分化和钙化;3.M2可通过调控SGK1-TGFβ1轴诱导MAoSMCs骨/软骨样转分化和钙化。
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