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本文以重组非糖基化人促红细胞生成素(rh—ngEpo)为目标蛋白质,对以包涵体形式表达的rh—ngEpo的制备过程和聚乙二醇(PEG)化修饰策略进行了详细研究,对单修饰产物的药代动力学和药效学性质进行了评估,并与糖基化人促红细胞生成素(rhEpo)进行比较,探索PEG修饰取代糖基化提高rh-ngEpo体内生物活性策略的可行性。
实验考察了常用的复性添加剂对rh-ngEpo复性收率的影响,发现蔗糖、环糊精、甘油、吐温、PEG均不能有效的抑制聚集沉淀。2 M脲、1 M盐酸胍和0.5 M精氨酸能有效抑制复性时不溶性聚集体的形成,但2 M脲时复性蛋白以可溶性寡聚体的形式存在,1 M盐酸胍则抑制了蛋白质的折叠,只有0.5 M精氨酸既能抑制聚集沉淀,又能提高正确折叠结构的含量,复性率最高。实验发现,阳离子交换层析能够有效除去复性液中的大部分高分子量杂蛋白,但不能除去复性过程形成的可溶性聚集体,因此通过离子交换层析纯化后,又采用凝胶过滤层析除去可溶性聚集体。整个工艺流程的蛋白质量收率为17％,rh-ngEpo的纯度大于95％,免疫活性达到了2.13×105 IU/mg,高于rhEpo的1.81×105 IU/mg。
对精氨酸辅助rh—ngEpo复性的动力学过程研究发现,高浓度精氨酸会大大延缓蛋白的复性速率,同时还会促进可溶性寡聚体的形成,降低复性效率。GSSG可以提高rh-ngEpo在精氨酸中的折叠速率,但也促进了分子间的二硫键配对,降低了收率。此外,我们发现精氨酸抑制聚集的能力与蛋白复性早期形成的爆破相中间体的疏水性有关,中间体的疏水性越强,精氨酸抑制其形成不溶性聚集体的能力就越弱。
通过在变性条件下利用阳离子交换柱从包涵体中纯化rh-ngEpo后再复性的新工艺,显著减少了旧工艺中包涵体洗涤时蛋白质量的损失,同时提高了后续复性和纯化单元的收率,简化了操作步骤,最终将活性蛋白的质量收率从旧工艺的17％提高到44％。纯化得到的rh-ngEpo的分子量与理论值相同,N末端序列、二硫键的位置以及二级结构也都和天然人促红细胞生成素一致。此外,rh-ngEpo的体外生物活性与糖基化的rhEpo基本相当。
利用分子量为20k的SC—PEG修饰rh-ngEpo,通过pH优化提高了组氨酸残基的修饰比例,较好的保留了rh-ngEpo的生物活性。动物实验结果表明,PEG修饰大大改善了rh-ngEpo的药代动力学性质,单修饰rh—ngEpo的AUC和循环半衰期分别比未修饰蛋白提高了14倍和11倍,但仍然不如糖基化的rhEpo。
为了获得体内稳定性和活性更为出色的耦合物,我们采用线形聚乙二醇丙醛(PEG-ALD,MW:20,30,40k)和分枝形聚乙二醇琥珀酰亚氨酯(PEG2-NHS,MW:40k)修饰rh-ngEpo,通过离子交换层析纯化得到了单修饰产物。修饰位点分析表明PEG-ALD的N末端修饰专一性达到了91％,而PEG2-NHS的单修饰耦合物为四种偶联位点异构体的混合物。实验发现,随着偶联PEG-ALD分子量的增加,耦合物的体外活性逐渐减小。40k-PEG-ALD-rh—ngEpo的比活为0.32×105±0.06×105IU/mg,显著高于40k-PEG2-NHS-rh-ngEpo的0.15×105±0.04×105IU/mg,说明N末端定点修饰比随机修饰更好地保留了rh-ngEpo的生物活性。PEG修饰还提高了rh-ngEpo的热稳定性、体外血浆稳定性和抗变性能力,偶联PEG的分子量越大,耦合物就越稳定,40k-PEG2-NHS-rh-ngEpo展现出了优于40k-PEG-ALD—rh—ngEpo的稳定性。
PEG修饰显著提高了rh-ngEpo的药代动力学性质,两个40k—PEG-rh-ngEpo都展现出了优于rhEpo的代谢稳定性,其中40k-PEG2-NHS-rh-ngEpo的药代动力学性质显著优于40k-PEG-ALD-rh-ngEpo。
PEG修饰赋予了rh-ngEpo体内促红细胞生成活性。耦合物中两个40k—PEG—rh-ngEpo的体内活性最佳,并且在5-40μg/kg体重的剂量范围内与rhEpo的体内活性相当,说明耦合物突出的药代动力学性质可以在一定程度上弥补其受体结合能力低的缺点。