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雷公藤(tripterygium wilfordii hook F,TWHF)是一种藤本植物,主要产于中国南方,包括浙江、湖南、安徽、云南、福建、台湾等地区。关于其药用的最早记录出现在1476年兰茂所著的《滇南本草》中。它在20世纪60年代开始引起全世界的关注,它的提取物被证明对治疗类风湿性关节炎非常有效。雷公藤甲素(triptolide,TP)又称雷公藤内酯醇,是从TWHF的粗提取物中分离的复合三环氧化物二萜。作为TWHF的主要生物活性成分之一,它在体外和体内均具有独特的生物活性,然而在雷公藤甲素达到其临床潜力之前,仍然需要克服众多问题,例如水溶性差,治疗窗口狭窄和多器官毒性,长期使用可导致严重的不良事件,如肝肿大,肝损伤,目前TP诱发肝脏损伤的确切作用机制尚不明确。肝脏是药物代谢的主要场所,可以通过肝脏微粒体中的多种酶系进行生物转化,其中最重要的是细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)。CYP450是一组结构和功能相关的同工酶,主要存在于生物体的内质网内,是混合功能氧化酶中最重要的一种酶系。TP在大鼠肝微粒体中代谢主要由CYP3A介导,人类肝脏中CYP3A酶以CYP3A4为主。该文主要研究TP诱导CYP3A4表达下调在其引发肝损伤中的作用。主要方法如下:1.细胞实验:将L-02细胞随机分为4组,分别为正常组(C)、雷公藤甲素(TP)组、雷公藤甲素(TP)+卡马西平(CBZ)组、雷公藤甲素(TP)+氨氯地平(AML)组。24 h后收集培养基,流式细胞仪观察用药后各组细胞的凋亡率。试剂盒检测细胞上清液的ALT、AST。通过Western blot法和RT-PCR法检测细胞CYP3A4的m RNA和蛋白表达水平,应用高效液相色谱法检测细胞培养基中雷公藤甲素的含量。流式细胞仪检测的细胞凋亡结果显示,TP组明显比C组严重,加入P450 3A4诱导剂的TP+CBZ组则明显减轻,而加入P450 3A4抑制剂的TP+AML组的细胞进一步加剧。体内外ALT和AST检测结果显示,TP组明显高于C组,TP+CBZ组则明显降低,TP+AML组进一步增加。Western blot法和RT-PCR结果显示,TP组CYP3A4表达量明显低于C组,TP+CBZ组的CYP3A4表达量则明显升高,TP+AML组的CYP3A4表达量更低。高效液相检测结果显示,TP+CBZ组中TP的含量低于TP组,而TP+AML组中TP的含量则相反。2.动物实验:将C57BL/6雄性小鼠随机分为4组,分别为正常组(C)、雷公藤甲素(TP、0.6mg/kg/day)组、雷公藤甲素(TP、0.6mg/kg/day)+卡马西平(CBZ、24mg/kg/day)组、雷公藤甲素(TP、0.6mg/kg/day)+氨氯地平(AML、1.0mg/kg/day)组,C57BL/6雄性小鼠2周后安乐死,取血和肝脏。小鼠肝脏进行组织染色观察肝细胞损伤情况。试剂盒检测小鼠血清的ALT、AST。通过Western blot法和RT-PCR法检测小鼠肝脏CYP3A4的m RNA和蛋白表达水平,应用高效液相色谱法检测小鼠血清中雷公藤甲素的含量。小鼠肝脏病例照片结果显示,TP组明显比C组严重,加入P450 3A4诱导剂的TP+CBZ组则明显减轻,而加入P450 3A4抑制剂的TP+AML组的细胞进一步加剧。体内外ALT和AST检测结果显示,TP组明显高于C组,TP+CBZ组则明显降低,TP+AML组进一步增加。Western blot法和RT-PCR结果显示,TP组CYP3A4表达量明显低于C组,TP+CBZ组的CYP3A4表达量则明显升高,TP+AML组的CYP3A4表达量更低。高效液相检测结果显示,TP+CBZ组中TP的含量低于TP组,而TP+AML组中TP的含量则相反。本研究的实验结果显示TP对L-02细胞和C57BL/6雄性小鼠的CYP3A4的表达均有明显的抑制作用,与此同时,TP对L-02细胞和C57BL/6小鼠肝脏均有损伤作用。加入CYP3A4抑制剂AML后,CYP3A4的表达进一步减少,TP含量明显增加,提示TP代谢降低,其结果是TP对L-02细胞以及小鼠肝脏的损伤增大;与之相反,加入CYP3A4诱导剂CBZ后,CYP3A4的表达明显增加,TP含量明显降低,提示TP代谢加速,产生的结果是TP对L-02细胞和小鼠肝脏的损伤则显著降低。由上述结果可能得出结论,TP通过抑制了CYP3A4的表达,减慢自身代谢,因而造成对了肝脏的损伤,但是否是产生肝损伤的主要机制还有待下一步的实验证明。