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研究背景癌症是公共健康中的首要关注问题,为人类带来了巨大而沉重的社会负担。在女性恶性肿瘤中,乳腺癌的发病率约为30%,位于第一位,死亡率也高居女性恶性肿瘤的第二位。同样,我国乳腺癌的发病率高达17.07%,也居第一位,而且呈现年轻化趋势。虽然近年来,乳腺癌患者的整体生存率和预后有所提高,但进展转移仍是导致乳腺癌患者死亡的最主要的原因,可使乳腺癌患者的5年生存率（overall survival）由高于90%降低至不超过30%。因此,揭示乳腺癌转移的新机制并寻找新的治疗靶点对于提高患者预后具有重要作用。研究表明,蛋白质编码基因仅占基因组的3%,其余97%为具有分子功能的“暗区”转录本,可以转录成各种RNA,其中大多数不编码蛋白质,称为非编码RNA（ncRNAs）。其中,长链非编码RNA（lncRNA）是目前研究较为深入的一种非编码RNA,能够通过多种机制调控原癌基因或者抑癌基因的表达及功能,从而在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用,例如,调节蛋白和RNA的稳定性、转录修饰、形成核内脚手架或介导蛋白与DNA的相互作用等。LncRNA BCYRN1能够与miR-619-5p竞争性结合从而调控CUEDC2的表达,激活PTEN/AKT/P21通路,从而抑制胶质瘤的发生发展;LINC00319能够经CCL18诱导表达升高,从而通过miR-199a-5p/FZD4通路促进口腔鳞状细胞癌的增殖和转移;LncRNA MALAT1能够结合并灭活TEAD,阻止TEAD与YAP的结合,从而抑制乳腺癌的进展转移;lncRNA LINC-A可以通过激活HIF-1α信号通路促进三阴性乳腺癌糖酵解和肿瘤发生。因此,从lncRNA的角度,将有助于发现和阐明乳腺癌进展转移的新机制,能够为乳腺癌的诊断、预后预测等提供新的方向和理论基础,具有重要的临床应用意义和社会价值。多种研究表明,lncRNA可以通过竞争性内源性RNA机制（ceRNA）靶向吸附miRNA从而调控下游靶基因的表达。例如,linc00963在乳腺癌中能够作为miR-324-3p的ceRNA而调控肿瘤发生发展及放疗耐受性;NONHSAT101069能够作为miR-129-5p的ceRNA而减少对Twistl表达的抑制作用,从而加强乳腺癌细胞对表柔比星的耐药性。虽然目前研究揭示了 lncRNA的诸多调控机制,但由于一个lncRNA可吸附多个miRNA,而每个miRNA又有多个下游靶基因的3’UTR区的结合位点,从而形成了一个十分复杂的lncRNA的调控网络,因此需要进一步的整合分析,以寻找其中的关键lncRNA调控通路。近年来,生物信息学相关研究迅猛发展,大量科学研究者利用高通量测序技术获得了海量数据,并通过多种分析软件及数据库进行分析处理,从而从错综复杂的数据中筛选出关键调控因子。在本研究中,我们分析了 GEO和TCGA数据库中由高通量测序技术得到的lncRNA、miRNA、mRNA的表达情况,之后结合生物信息学分析结果、数据库预测、细胞及组织内表达检测等结果,构建了乳腺癌相关的lncRNA调控网络并从中筛选出关键lncRNA,DGUOK-AS1（lncRNA deoxyguanosine kinase antisense RNA 1）。之后,我们利用体外及体内实验,进一步深入探究了 DGUOK-AS1在乳腺癌进展转移中的具体功能及其调控机制。第一部分基于生物信息学分析构建乳腺癌相关的lncRNA调控网络研究目的1.探究乳腺癌组织中lncRNA、miRNA和mRNA的差异表达情况。2.构建乳腺癌相关lncRNA调控网络并筛选乳腺癌进展转移的关键lncRNA。3.分析乳腺癌组织及乳腺癌细胞中关键lncRNA（DGUOK-AS1）的表达情况4.评价关键lncRNA（DGUOK-AS1）表达情况与乳腺癌患者预后的相关性。5.构建乳腺癌预后预测模型并评价其临床应用价值。研究方法从GEO和TCGA数据库中得到乳腺癌组织及癌旁正常组织lncRNA、miRNA和mRNA的表达谱,并利用R语言中的limma数据包及edgeR数据包筛选差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA。通过WGCNA分析进一步探究差异lncRNA与乳腺癌的相关性。基于 DIANA-LncBase v2、miRTarBase,Starbase、TargetScan 及 miRDB数据库的预测结果及差异分析结果,共同绘制一个lncRNA-miRNA-mRNA调控网络图,Cytoscape可用于将此调控网络可视化。利用STRING数据库构建所获得的调控网络中差异表达的mRNA的蛋白-蛋白互作（PPI）网络,并用Cytoscape软件进行可视化,之后利用cytoHubba模块提取PPI中的关键基因。运用GO分析和KEGG分析探究这些关键基因的相关功能和可能参与的信号通路。基于关键基因构建子调控网络,并筛选出乳腺癌相关关键lncRNA。利用实时定量PCR（qRT-PCR）分析关键lncRNA（DGUOK-AS1）在乳腺癌细胞及乳腺癌组织中的表达情况。通过qRT-PCR检测182例乳腺癌组织中关键lncRNA（DGUOK-AS1）的表达情况,从而将乳腺癌患者分成DGUOK-AS1高表达组和DGUOK-AS1低表达组。Kaplan-Meier法用于绘制乳腺癌患者的生存曲线Log-Rank法用于分析DGUOK-AS1高表达组和DGUOK-AS1低表达组间的生存率差异,Cox单/多因素回归分析、Lasso分析等,评估关键lncRNA的表达情况与乳腺癌患者预后的相关性。研究结果本研究共筛选出6个在乳腺癌组织及正常组织中差异表达的lncRNA（DElncRNA）,29个差异表达的miRNA（DEmiRNA）和253个差异表达的mRNA（DEmRNA）。WGCNA结果显示,上调lncRNA的表达情况与乳腺癌正相关,而下调lncRNA的表达情况与乳腺癌呈负相关性。结合数据库预测结果,初步构建了一个包含6个lncRNA、29个miRNA及253个mRNA的乳腺癌相关调控网络。通过分析253个mRNA的相关性,进一步建立了蛋白-蛋白相互作用网络。利用cytoHubba模块从中提取出7个关键基因,并最终构建了一个包含2个DElncRNA,5个DEmiRNA和7个关键基因的调控子网络。GO分析和KEGG分析结果显示,关键基因主要参与有丝分裂、细胞周期、p53通路、代谢等途径。通过分析子网络中分子的表达情况,基于竞争性内源性RNA机制,我们最终选择DGUOK-AS1为乳腺癌相关的关键lncRNA。在乳腺癌细胞中DGUOK-AS1的表达量明显高于正常乳腺细胞,并且我们也在乳腺癌组织中对DGUOK-AS1的表达量进行验证,发现其在肿瘤组织中的表达水平也明显高于癌旁正常组织。预后分析结果显示,DGUOK-AS1的表达量与乳腺癌患者的预后情况呈明显的负相关性,因此可作为影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。同时,我们进行了多因素回归分析,并揭示出三个独立的预后影响因素,并构建了一个包含组织学分级、淋巴结状态和DGUOK-AS1表达情况的预后模型,在乳腺癌预后预测方面具有重要的价值。研究结论1.lncRNA、miRNA、mRNA的表达模式在乳腺癌组织中不同于正常乳腺组织,根据差异表达结果及预测结果构建了乳腺癌中复杂的lncRNA调控网络。2.基于关键调控网络分析,筛选出DGUOK-AS1在为乳腺癌相关关键lncRNA。3.DGUOK-AS1在乳腺癌细胞及肿瘤组织中的表达升高,并可能在乳腺癌进展过程中发挥促癌基因样作用。4.DGUOK-AS1与乳腺癌预后呈负相关,在预后预测方面具有重要的价值。第二部分 LncRNA DGUOK-AS1 通过吸附 miR-204-5p 而靶向调控 IL11进而促进乳腺癌的进展转移研究目的1.分析DGUOK-AS1对乳腺癌细胞增殖、转移的作用。2.探究DGUOK-AS1在体内对肿瘤进展转移的影响。3.阐明DGUOK-AS1在乳腺癌的进展转移过程中的分子调控机制。研究方法在乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7等）中敲低或者过表达DGUOK-AS1,并检测DGUOK-AS1在乳腺癌细胞中的功能。利用MTT实验、克隆形成实验、EdU实验等方法评价DGUOK-AS1对不同乳腺癌细胞的增殖能力的作用。通过体外进行的划痕实验、transwell细胞迁移实验和细胞侵袭实验等实验方法评价DGUOK-AS1对乳腺癌细胞的转移的作用。应用western blot（WB）检测特定蛋白的表达变化情况。综合评价生物信息学分析所得的结果及网站预测得到的结果,筛选并验证DGUOK-AS1在乳腺癌进展转移中的分子调控通路。利用RIP、luciferase、qRT-PCR 验证 DGUOK-AS1 与 miR-204-5p/IL11 的调控机制。通过裸鼠成瘤实验及尾静脉转移模型在体内检测DGUOK-AS1对乳腺癌进展转移的影响。研究结果MTT、克隆形成、EdU的结果显示,DGUOK-AS1敲低后多种乳腺癌细胞的增殖作用被十分明显地抑制,反之DGUOK-AS1过表达后多种乳腺癌细胞的增殖作用被十分明显地增强。划痕实验、transwell细胞迁移和侵袭实验等的结果也显示,DGUOK-AS1敲低后多种乳腺癌细胞的转移作用被十分明显地抑制,反之DGUOK-AS1过表达后多种乳腺癌细胞的转移作用被十分明显地增强。结合生物信息学分析所得的结果、网站预测得到的结果及实验验证结果等,我们证实了DGUOK-AS1能够吸附miR-204-5p从而靶向调控IL11的表达,而且miR-204-5p过表达能够部分抑制DGUOK-AS1过表达所导致的促癌表型。此外,进一步的体内裸鼠皮下成瘤实验及肺转移模型的结果也表明,DGUOK-AS1在体内也发挥着促进乳腺癌的进展转移的功能。研究结论1.体外试验证实DGUOK-AS1可以显著提高多种乳腺癌细胞的增殖能力及转移能力。2.体内试验证实DGUOK-AS1可以显著促进乳腺癌的进展转移。3.DGUOK-AS1可以通过影响miR-204-5p/IL11通路而在乳腺癌中发挥促癌作用。