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水稻是世界第二大粮食作物,占世界人口总摄入食物的20%。磷是维持植物生命活动的必需营养元素,几乎一半的水稻土壤缺磷,磷缺乏成为水稻产量重要的限制因素。在缺磷土壤中水稻吸收利用磷的能力存在基因型差异,研究水稻耐低磷机制对解决水稻面临的磷营养胁迫有重要的意义。目前对水稻磷胁迫响应的分子机制所知不多,miRNA在植物磷胁迫响应中作用被发现为揭示水稻耐低磷分子机制提供一条新思路。miRNA是在真核生物中广泛存在的一类长度约20~24 nt的非编码单链分子,通过降解目的基因或抑制目的基因的翻译在转录后水平调控基因的表达。研究发现microRNA在各种生物或非生物胁迫中发挥着重要的作用。
本研究以水稻9311为材料,首先对其进行磷效率评价,然后利用microarray技术筛选在高磷和低磷下差异表达的miRNAs,并对部分磷响应miRNAs用定量PCR的方法在根部进行验证和表达模式分析,并分析了磷响应miRNAs在磷饥饿后恢复供磷条件下的表达模式,在此基础上对磷响应miRNAs进行染色体信息分析和靶基因预测。获得结果如下:
1)对水稻9311的磷效率进行评价,发现不同磷处理下9311、Kasalath、Nipponbare的磷效率存在基因型差异,在正常供磷下,Kasalath在后期的生物量、磷含量、最大根长、总根长、根表面积、根体积、分蘖数均为最大值,9311次之,Nipponbare最低,而前期9311表现比较好。在缺磷下,三个品种表现出对低磷不同的适应机制,并受到外界环境的影响。Kasalath的根系在两季都伸长,Nipponbare的根系变化不大,9311的根系在28天时变化不大,42天时小幅伸长63天时根系长度增加较多,但低于Kasalath。
2)通过芯片实验分别从地上部和根部筛选发现了磷响应的miRNAs,在根部发现14个下调的miRNAs,7个上调的miRNAs;在地上部发现17个下调的miRNAs,13个上调的miRNAs。对芯片结果进行深度分析,发现在高磷和低磷下根部有差异的70个、在地上部有差异的74个miRNAs,地上部和根部低磷下有差异的86个、高磷下有差异的89个miRNAs,并且发现76个相同的miRNAs在高磷和低磷下的地上部和根部有差异,但信号值和比值不同。
3)对芯片筛选出的13个有代表性的磷响应miRNAs用定量PCR的方法在根部进行了验证,发现miR166i、miR528、miR529b、ADS9、ADS23、ADS32、miR444b.2芯片结果与定量结果都为下调的,而miR159a、miR319a、ADS29、miR169b、miR169h与芯片结果相反,并且发现磷响应miRNAs在低磷和高磷下的根部表达模式不同,在各取样点的表达情况表现出强烈的时间依赖性。
4)对恢复供磷情况下的miRNAs在根部和地上部的表达特征进行分析,miR528在供磷后的根部和地上部的表达模式相同,其它miRNAs在供磷条件下地上部和根部的表达不同,表现出组织和时间特异性。磷响应miRNAs在根部供磷和磷饥饿下表达模式不同,供磷后除miR1432外其它成熟的miRNAs在1小时表达量最高。
5)对磷响应miRNA的染色体信息和靶基因进行分析,发现成熟的磷响应miRNAs分布在水稻的第1、2、3、4、6、7、8条染色体上;磷响应miRNAs的靶基因的功能主要涉及:转录因子、与植物代谢有关的酶蛋白、与信号转导和胁迫有关的蛋白质、未知功能及功能不清楚的蛋白质序列。