厌氧发酵产氢与其它产氢技术相比，具有反应条件温和、反应器设计简单、产氢效率相对较高、能够将各种廉价的有机废弃物转化为能源等优点，因此成为当前能源领域的研究热点。然而，自然界中野生菌株产氢效率低一直是厌氧发酵产氢工业化亟待解决的关键问题。敲除产氢代谢负调控因子或其竞争途径的关键酶基因；利用辅酶工程策略调控产氢微生物的代谢方向及优化产氢发酵关键参数是解决这一瓶颈问题的有效途径。克雷伯菌作为兼性厌氧发酵细菌具有底物适应性强，培养容易，产氢潜力较高的特性。到目前为止，利用该菌进行产氢研究的相关报道主要集中于优化产氢发酵条件和寻找廉价底物等方面，而利用基因工程手段提高其产氢能力的研究少见。在此背景下，本研究以前期本实验室筛选出来的克雷伯菌Klebsiella sp. HQ-3作为出发菌株，通过敲除与产氢有竞争作用的产琥珀酸途径关键酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC, phosphoenolpyruvate carboxylase）基因和过表达合成NADH过程中的NAD合成酶达到提高产氢效率的目的，并初步探索该菌产氢代谢机理；在此基础上，进一步运用响应面法优化其发酵过程中的显著因子，确定了工程菌最佳的产氢培养条件。具体研究内容和结果如下：（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的敲除。运用简并PCR，以克雷伯菌HQ-3基因组为模板，扩增得到编码产琥珀酸代谢途径关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。利用Red重组系统敲除ppc基因，获得的工程菌命名为HQ-3-P（Δppc）。产氢发酵对比实验表明工程菌HQ-3-P的产氢效率为0.762mol H2/mol葡萄糖，比野生菌的产氢量增加24.21%。（2）来源于产气肠杆菌的NAD合成酶的过表达。将含NAD合成酶基因（nadE）的表达载体pET28-pkan-nadE分别电转到野生菌株HQ-3和重组菌HQ-3-P中，得到异源表达菌株HQ-3-N(nadE)和HQ-3-P/N(Δppc/nadE)。发酵结果表明，表达NAD合成酶的菌株生长速率均有所提高，其中表达了NAD合成酶的工程菌的产氢效率由0.762mol H2/mol葡萄糖提高到0.786mol H2/mol葡萄糖，而表达了NAD合成酶的野生菌的产氢效率由0.581mol H2/mol葡萄糖提高到0.620mol H2/mol葡萄糖。（3）发酵条件优化。通过单因素实验得到接种量、初始pH和温度为工程菌HQ-3-P产氢发酵过程中的显著因素，实验结果表明在不考虑交互作用的前提下，接种量20%，初始pH7.0，发酵温度33℃为最适条件。在此基础上，运用响应面法，采用Central Composite Design (CCD)设计实验条件，响应值利用统计学软件Design-Expert8.0.5进行分析、预测，得出最优发酵条件：温度为31.81℃，接种量为21.03%，初始pH值为7.14。通过实验验证得到的实际产氢效率为1.125mol H2/mol葡萄糖，与预测值1.111mol H2/mol葡萄糖吻合。