目的：　　流行病乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，又称为日本脑炎，简称乙脑。我们赴福建省和广东省采集家鼠和野鼠的样本，检测其是否携带乙脑病毒，并且建立乙脑病毒感染的小鼠模型，检验其携带乙脑病毒的能力。　　方法：　　1、家鼠和野鼠样本的采集　　2013-2015年在广州市以及厦门市部分公园、医院、农贸市场、学校等地方捕鼠。鼠笼放置的地点主要有建筑墙角、下水道、草丛、垃圾桶旁等。心脏采血处死，无菌开颅，取出部分脑组织。血液样本静置1h后，3500g/min离心15min，分离出上层血清。采集的标本置于，-80℃冰箱保存，待检。　　2、家鼠和野鼠脑组织样本乙脑病毒的检测　　采用Roche High Pure viral RNA kit提取鼠脑组织病毒RNA，用RocheTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录合成cDNA，以逆转录产物cDNA为模板，利用荧光定量RT-PCR法和普通RT-PCR法检测脑组织中的乙脑病毒。　　3、家鼠和野鼠血清样本乙脑病毒抗体的检测　　采用间接ELISA检测鼠血清样本乙脑病毒IgG抗体，将阳性样本用病毒中和实验测定中和抗体滴度，然后，用间接ELISA检测鼠血清样本登革病毒IgG抗体，排除登革感染。　　4、乙脑病毒感染NIH小鼠模型的建立　　4.1病毒株:本研究使用的2株乙脑病毒株均属于GⅢ型，GD乙脑病毒株于2009年广东地区的大足鼠耳蝠脑组织中分离、鉴定并保存，NAK株(Nakayama株，中山株)乙脑病毒是首次从日本乙脑病人体内分离的乙脑病毒株，由本实验室保存。病毒株通过颅内接种3日龄乳鼠进行病毒扩增，将病毒过滤液感染BHK-21细胞，制成病毒液，并测定TCID50。　　4.2乙脑病毒株半数致死量测定:分为2个病毒株组(NAK组和GD组)，每个组分为6个剂量小组(100～105 TCID50/100μL)，每个剂量小组有6只NIH小鼠，雌雄各半，5～6周龄，共用72只小鼠。设立1个对照组，共6只小鼠。将原病毒液稀释成100～105 TCID50/100μL6个浓度梯度。采用腹腔注射的方式，按不同的浓度梯度分组，每只小鼠100μL。对照组给予每只小鼠100μL PBS溶液。注射乙脑病毒后，共观察21天。将发病死亡的小鼠无菌解剖，取脑组织进行乙脑病毒检测。将不发病小鼠在感染病毒后21天眼球取血、处死，检测血清乙脑病毒中和抗体。　　4.3乙脑病毒感染小鼠:分为2个病毒株组(NAK组和GD组)，每个病毒株组有30只小鼠，雌性，5～6周龄，共用60只小鼠。设立1个对照组，共15只小鼠。　　(1)初次感染:采用腹腔注射的方式，按不同的病毒株组，给予每只小鼠乙脑病毒毒力为103 TCID50/100μL，100μL。对照组给予每只小鼠100μLPBS溶液。病毒组分别在感染后4、7、8、10、11、12、13、14、17d剖杀1-3只小鼠，对照组在相同的时间剖杀1只小鼠，下颌下取血后处死，并分离出上层血清。无菌解剖后取脑、肝、脾样本。检测小鼠血液、脑、肝、脾乙脑病毒的检测，检测小鼠血清乙脑病毒中和抗体。　　(2)再次感染:初次感染35d后，将存活的小鼠进行再次感染，NAK组、GD组注射病毒毒力和剂量如前，对照组腹腔注射NAK株乙脑病毒，103 TCID50/100μL，100μL。再次感染后，观察小鼠的死亡情况，分别在再次感染后7、14、21d下颌下取约500ul血液。再次感染21d取血后，处死全部小鼠。检测小鼠血清乙脑病毒中和抗体。　　4、质量控制　　(1)移液枪头、冻存管、EP管等实验耗材均为一次性用品;　　(2) RNA的提取和逆转录所用的容器和试剂如移液枪头、EP管等，均事先进行DEPC水处理，防止环境中RNA酶的污染;　　(3)细胞培养的所有操作均在细胞培养间的超净台内进行，防止污染;　　(4)鼠的解剖在无菌间生物安全柜进行，全程戴帽子、口罩和手套，做好个人防护工作;　　(5)实验过程严格设立阴、阳性对照及空白对照;　　(6)鼠的血清采集和保存应严防细菌污染。　　结果：　　1、家鼠和野鼠样本采集的基本情况　　本次研究在广州市和厦门市部分地区共采集了198只鼠，包括褐家鼠(Rattus norvegicus)159只，黄毛鼠(Rattus lossea Swinhoe)27只，黄胸鼠(Rattusflavipectus)10只，小家鼠(Mus musculus Linnaeus)2只。共获188份鼠脑组织样本，96份鼠血清样本。　　2、家鼠和野鼠脑组织样本乙脑病毒的检测　　采用荧光定量RT-PCR和普通RT-PCR对188份脑组织样本进行乙脑病毒的检测，结果均为阴性。　　3、家鼠和野鼠血清样本乙脑病毒抗体的检测　　对采集的96份鼠血清样本进行乙脑病毒IgG抗体检测，结果显示45.8％(44/96)血清样本为阳性。广州市和厦门市鼠乙脑病毒IgG抗体检测率分别为44.1％(15/34)，46.0％(29/62)。对上述乙脑病毒IgG抗体阳性的44份血清样本进行乙脑病毒中和抗体滴度测定，由于有8份样本血清量不足，只对36份样本进行了病毒中和试验。试验结果显示，61.5％(24/39)血清样本为乙脑病毒中和抗体阳性（抗体滴度≥1∶10），中和抗体滴度为1∶10～56。对上述乙脑病毒IgG抗体阳性的44份血清样本进行登革病毒IgG抗体，ELISA结果显示，这些血清样本均未登革病毒IgG抗体，可排除登革病毒的感染。　　4、乙脑病毒感染NIH小鼠模型的建立　　4.1小鼠感染乙脑病毒后的症状:NAK株病毒组中，小鼠初次感染乙脑病毒8d后，开始发病，出现弓背后肢瘫痪、震颤、行动迟缓、眼眶出血等症状，感染14d后，剩余的小鼠没有发生发病或死亡。GD株病毒组中，小鼠初次感染乙脑病毒7d后，开始发病，出现上述类似的症状。对照组中，没有小鼠死亡。　　4.2乙脑病毒株半数致死量实验的结果:NAK株病毒组中，100～105 TCID50/100μL小组小鼠死亡的数量分别为3、1、4、1、3、5，GD株病毒组中分别为0、2、4、5、1、5。由于各剂量小组小鼠死亡数量没有规律，无法计算乙脑病毒株的半数致死量。2个病毒株组中，小鼠血清中和抗体平均滴度随着病毒毒力的上升而升高。本研究选定103TCID50/100μL作为乙脑病毒感染小鼠实验的毒力浓度。　　4.3小鼠初次感染乙脑病毒结果:　　(1)小鼠血清样本中乙脑病毒检测结果:NAK病毒株组，感染后8d、10d、11d小鼠血清为乙脑病毒阳性，病毒载量为3.8×101～1.6×104 copies/mL。GD病毒株组，可在感染后4d、7d、10d、11d、14d小鼠血清检测出乙脑病毒阳性，病毒载量为0.7～9.8×102 copies/mL。　　(2)小鼠脑组织样本中乙脑病毒检测结果:NAK病毒株组，感染后4d、7d、8d、10d、11d、14d小鼠脑组织标本中检测出乙脑病毒阳性，病毒载量为7.25×105～1.70×109 copies/mL。GD病毒株组，可在感染后4d、7d、8d、10d、11d小鼠脑组织标本中检测出乙脑病毒阳性，病毒载量为6.7～7.4×108 copies/mL。　　(3)小鼠脾组织样本中乙脑病毒检测结果:NAK病毒株组，运用荧光定量在感染后4d、11d小鼠脾脏组织中检测出乙脑病毒阳性，病毒载量为2.2～13.5copies/mL。GD病毒株组，可在感染后4d、8d、10d小鼠脾脏组织中检测出乙脑病毒阳性，病毒载量为0.3～84.9 copies/mL。　　(4)小鼠肝组织样本中乙脑病毒检测结果:NAK病毒株组，GD病毒株组，对照组未在小鼠肝脏样本检测出乙脑病毒。　　(5)小鼠血清乙脑病毒中和抗体检测结果:小鼠初次感染乙脑病毒后，NAK、GD病毒株组乙脑病毒中和抗体滴度随时间的变化呈上升的趋势，NAK病毒株组从10d开始，血清乙脑病毒中和抗体滴度大于1∶20，GD病毒株组从11d开始，中和抗体大于1∶20，而对照组小鼠的中和抗体均未检出。　　4.4小鼠再次感染血清乙脑病毒结果　　(1)小鼠死亡情况观察:对照组注射乙脑病毒8d后，开始有小鼠发病死亡，症状如前，观察结束后，对照组有3只小鼠存活。NAK组、GD组未见小鼠发病死亡。　　(2)小鼠再次感染后血清乙脑病毒中和抗体检测:小鼠再次感染乙脑病毒后，NAK组和GD组在感染后7d抗体滴度均大于1∶300，中和抗体滴度随时间的变化，呈下降的趋势。对照组感染乙脑病毒14d后，中和抗体滴度大于1∶20，中和抗体滴度随时间的变化，呈下降的趋势。　　结论：　　1、广州和厦门地区家鼠及野鼠鼠脑组织中未分离出乙脑病毒，而血清中携带较高的乙脑病毒抗体，提示曾感染乙脑病毒。本研究提示对鼠在乙脑传播中的作用值得进一步研究。　　2、小鼠对人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙脑病毒株均易感，并出现与乙脑病人相似的症状。小鼠感染人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙脑病毒株后，出现病毒血症，并存在中和抗体和病毒共存的时期，具备潜在的传播乙脑病毒的能力。高滴度的中和抗体对小鼠有保护作用，而低滴度中和抗体的效能尚不明确。