论文部分内容阅读
目的：乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是全世界的重大健康问题，可引起慢性肝炎、肝硬化、肝纤维化等严重的肝脏疾病，并是肝细胞癌的重要危险因素，据报道HBV在病毒相关的肝细胞癌中约占80%。HBV是一种小的有包膜的嗜肝DNA病毒，基因组为部分双链、松弛闭合的环状DNA，但其复制过程中有RNA逆转录病毒的特性，其编码的HBV DNA聚合酶（HBV DNA Pol）具有逆转录酶活性，能够识别并结合HBV前基因组RNA（pgRNA）的ε元件启动HBV基因组的复制，并与pgRNA形成复合体包装进入核衣壳，催化pgRNA逆转录为DNA；同时具有DNA聚合酶活性，完成HBV DNA双链的形成，在HBV复制中发挥重要作用。因此对于HBV DNA Pol的调控研究有助于深入了解HBV复制过程。三重基序蛋白（Tripartite motif protein,TRIM）家族具有三个保守的结构域（RING环、B-box盒和卷曲螺旋结构域），此外还有一个可变的C末端。该家族成员参与细胞分化、增殖、发育、凋亡等多种生物学过程，近年来的研究表明一些TRIM蛋白具有抗病毒的功能，特别是对逆转录病毒具有抑制作用，并参与先天免疫途径的调控。TRIM21作为TRIM家族成员之一，是细胞内IgG Fc的受体，其通过结合随病毒进入宿主细胞的抗体，促进靶蛋白经泛素化降解，从而快速降解病毒颗粒，提供了一种作用于病毒的、抗体依赖的非细胞毒素机制。本研究前期中我们通过Flag亲和纯化技术联合质谱分析发现TRIM21可能是HBV DNA Pol相互作用的一个蛋白，能够影响HBV DNAPol的蛋白表达水平。然而关于TRIM21对HBV复制影响的研究较少，本课题主要研究TRIM21对HBV复制的调控及作用机制。 方法：首先我们采用Flag亲和纯化技术联合质谱分析筛选HBV DNA Pol相互作用蛋白，通过在Gene及Pubmed等网站上查询基因功能及相关文献，选定TRIM21作为研究对象，并构建过表达及敲降TRIM21的质粒。通过CoIP实验及免疫荧光结合共聚焦显微镜图像采集分析确定HBV DNA Pol与TRIM21之间的相互作用及亚细胞定位。Western blot检测TRIM21对HBV DNA Pol表达的影响，放线菌酮实验检测TRIM21对HBV DNA Pol半衰期的影响，并采用溶酶体及蛋白酶体抑制剂处理细胞，研究HBV DNA Pol蛋白降解的主要途径，检测TRIM21及其E3连接酶活性缺失的突变体对HBV DNA Pol泛素化水平的影响。使用UbPred和CKSAAP网站预测HBV DNA Pol潜在的泛素化位点并构建位点突变质粒，研究TRIM21泛素化HBV DNA Pol的具体位点。同时在Huh7及HepG2.2.15细胞中采用ELISA分析TRIM21对HBeAg和HBsAg分泌的影响，RT-qPCR检测TRIM21对HBV DNA、cccDNA、pgRNA及病毒总RNA水平的影响。 结果：Flag亲和纯化技术联合质谱分析显示TRIM21等为可能的HBV DNAPol相互作用蛋白，免疫共沉淀实验和免疫荧光共聚焦显微镜图像分析证实了HBV DNA Pol与TRIM21具有相互作用及在细胞内的共定位。TRIM21下调HBV DNA Pol在细胞内的表达水平并缩短其半衰期，然而蛋白酶体抑制剂MG132可减弱这种调控作用。过表达TRIM21促进HBV DNA Pol在第260、283位赖氨酸位点的泛素化。而缺乏E3泛素连接酶活性的TRIM21突变体不具有促进HBV DNA Pol泛素化的能力。TRIM21抑制HBV HBeAg及HBsAg的分泌，HBV DNA及cccDNA的表达，pgRNA及病毒总RNA的水平。 结论：本研究证实了TRIM21与HBV DNA Pol相互作用并促进HBV DNA Pol经泛素-蛋白酶体途径降解，从而减弱了肝癌细胞中HBV DNA Pol的表达水平，并发挥抑制HBV复制的作用。