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研究背景:神经病理性疼痛(Neuropathic Pain, NPP)发病机制复杂,传统的抗炎药、钙离子通道拮抗剂、三环类抗抑郁药等,在NPP的治疗中非常局限,这使得NPP的治疗成为临床上亟待解决的问题。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)因其独特的生物学特点和优势如:增殖率高、遗传稳定、低免疫原性、免疫调节作用等特点,而直接用于神经病理性疼痛等疾病的治疗。但BMMSCs发挥治疗作用的机制尚不明确。研究表明小胶质细胞(Microglia, MG)在微量促炎因子作用下即可活化,活化后的MG可释放大量主导NPP发生与进展的炎性介质。因此,调节MG过度活化成为治疗NPP的重要途径。研究发现MSCs可被移植微环境中的促炎因子激活,通过自身旁分泌功能抑制MG过度活化进而减轻NPP的发展。但目前促炎因子预处理BMMSCs作用于NPP的研究较少。因此,研究预处理BMMSCs在NPP的发病过程中的作用具有重要意义。实验目的:探讨TNF- α预处理的BMMSCs对CCI大鼠镇痛作用及可能机制实验内容:1、培养并鉴定BMMSCs。2、体外情况下TNF- α预处理BMMSCs对其抑制MG活化作用的影响3、鞘内注射经TNF-α预处理的BMMSCs对CCI大鼠MG活化及疼痛行为的影响实验方法:1、采用贴壁分离法从雄性SD大鼠(3-4周龄)的股骨中分离BMMSCs。光镜下观察细胞形态、流式细胞学技术检测细胞表面标记物对所培养的细胞进行鉴定。2、选择雄性SD大鼠(6-8周龄)120只,参照Bennett法制备CCI模型,随机分为3组(n=40);①CCI组(A组):造模后第7天鞘内注射不含BMMSCs的PBS 20 μl;②BMMSC移植组(B组):造模后第七天鞘内注射含BMMSCs(1×106/只)的PBS20μl;③TNF-α预处理BMMSCs组(C组):造模后第七天鞘内注射含TNF-α处理后的BMMSCs (1×106/只)的PBS20μl。3、观察各组大鼠在手术前1天,术后第3、7、14、21、28天PWL、PWT。4、分别于手术前一天,术后第3、7、14、21、28天采用颈椎脱臼法处死大鼠,分别取大鼠脊髓(SL)、腰段背根神经节(DRG)。采用ELISA技术检测SL、DRG内TNF-α、IL-6、IL-10炎性因子水平;分别于术后14天取SL、DRG,采用免疫荧光技术检测SL、DRG小胶质细胞表面标记物CD68的表达水平。5、为进一步验证BMMSCs对小胶质细胞的影响,体外情况下采用LPS诱导MG活化,采用共培养的方法来检测BMMSCs对LPS活化后的MG的作用。利用含1000ng/ml的TNF-α完全培养液对BMMSCs进行预处理;利用LPS (10μg/ml)诱导大鼠MG活化。MG分离纯化后,以1x105/孔种植于6孔板中,按以下分组将MG和BMMSCs进行共培养24h。B组(单纯BMMSCs组)、L+B 组(LPS+ BMMSCs 组)、T+B 组(TNF-α 预处理 BMMSCs 组)、L+T+B 组(LPS+TNF- α 预处理 BMMSCs 组)、M 组(单纯 MG 组)、L+M 组(LPS+MG 组)、B+L+M 组(BMMSCs+LPS+MG 组)、T+B+L+M 组(TNF-α预处理 BMMSCs +LPS+MG 组)。6、24h后,取培养液上清,采用ELISA技术检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子表达含量,免疫荧光法检测MG表面标记物CD68抗体的表达水平。实验结果:1、采用贴壁分离法培养的BMMSCs,随着细胞不断传代纯化,细胞形态呈长梭状且呈旋涡状排列,细胞表型鉴定结果如下:CD29表达率99.59%,CD90表达率83.95%,呈阳性;CD34表达率0.1%, CD45表达率7%,呈阴性。2、与CCI组、单纯BMMSC组相比,TNF-α预处理BMMSCs组术前1天、术后28天PWT和PWL差异无统计学意义(p>0.05);在术后第3天PWT和PWL逐渐降低,术后第7天降至最低,之后缓慢升高,于术后28天恢复至基线水平,在此期间TNF-α预处理BMMSCs术后7、14、21天PWT、PWL值均升高,差异有统计学意义(p<0.05)。肉眼可见TNF-α预处理BMMSCs组大鼠精神状态好,术侧伤口恢复较快;与CCI组和单纯BMMSC组相比,差异显著。3、BMMSCs移植后进行ELISA检测发现:TNF- α预处理BMMSCs组腰段脊髓、腰段背根神经节内TNF-α、IL-6等促炎因子含量在术后第3、7天明显升高,术后第14、21天促炎因子含量逐渐降低,术后28天促炎因子含量达到基线水平,与CCI组和单纯BMMSC组相比,差异有明显统计学意义(p<0.05)。然而,TNF-α预处理BMMSCs组腰段脊髓、腰段背根神经节内抑炎因子IL-10在术后第3、7表达呈低水平,在术后第14天逐渐上升,21天达到高峰,术后28天基本降至术前水平,与CCI组和单纯BMMSC组相比,差异有明显统计学意义(p<0.05)4、与CCI组和单纯BMMSC组相比,SL、DRG中小胶质细胞CD68表达水平明显降低(p<0.05),而CD68在CCI组和单纯BMMSC表达无明显变化。5、L+M组小胶质细胞的CD68表达增高,分泌TNF-cα、IL-6含量明显增多;B+L+M组以及T+B+L+M组的小胶质细胞CD68表达水平、TNF- α、IL-6分泌量低于L+M组,且B+L+M组与T+B+L+M组相比有统计学差异(P<0.05)。实验结论:1、BMMSCs移植调节CCI大鼠的疼痛行为,发挥镇痛作用,经TNF-α预处理BMMSCs镇痛效果更强。2、体外实验下,BMMSCs和经TNF- α预处理的BMMSCs均可抑制LPS诱发的MG的活化且经TNF-α预处理后的BMMSCs对MG活化的抑制作用更强。3、经TNF- α预处理BMMSCs可抑制脊髓小胶质细胞活化并降通过低促炎因子水平、提高抑炎因子水平来减缓CCI大鼠的疼痛行为。