戊型肝炎（hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）引起的肝脏疾病,临床表现为急性肝炎,慢性肝病患者合并HEV感染可引发肝功能衰竭等严重后果,且HEV在孕妇中病死率高达20%。WHO资料表明全球每年约有2010万人被HEV感染,330万急性患者,并有大约70000人死亡。在中国HEV感染普遍存在,散发病例呈缓慢上升趋势,戊肝已成为全球和我国严重的公共卫生问题。HEV是一种单股正链RNA病毒,颗粒为正二十面体,直径约为35nm,基因组含ORF1、ORF2和ORF3三个读码框架。其中基因组ORF2为编码全长660个氨基酸（amino acid,aa）的单一结构蛋白（pORF2）。由于HEV体外培养技术不成熟,灭活疫苗尚未研制成功,因此研究主要集中于基因工程表达。目前有关ORF2蛋白的研究表现为在不同宿主细胞中表达不同长度的截短蛋白,并且这些蛋白可以组装成不同类型的HEV病毒样颗粒,分别为T=1和T=3。然而,到目前为止,ORF2全长1-660氨基酸组装成病毒颗粒的机制仍旧不完全清楚,尤其是C-末端氨基酸在病毒颗粒组装过程中的作用不明确。根据HEV全基因序列的差异,将HEV毒株分为4个基因型,分别是基因1型、2型、3型和4型。其中基因1、2型只感染人,基因3、4型既可感染人又可感染动物,为人畜共患型。HEV最主要的宿主为猪,并且猪是人戊型肝炎的主要传染源,HEV基因3、4型在猪和人之间相互感染,因此我们可以从消除传染源着手进行预防和控制人类HEV感染。由于猪感染HEV后并不发病,且有一定的自愈性,养猪者对接种疫苗很可能并不认可。因此,只有研制一种戊型肝炎和另一种对猪危害严重疾病的联合疫苗才能有效解决这一问题。口蹄疫（Foot-and-mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth Disease virus,FMDV）引起偶蹄类动物的高度传染性疾病。感染通过易感动物种群迅速传播导致大规模的动物死亡,可造成巨大的经济损失和政治影响,世界动物卫生组织（OIE）将FMD列为A类动物疫病之首。FMDV属于微小RNA病毒科口蹄疫病毒属,目前已知该病毒有7个血清型为O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型和亚洲Ⅰ型,我国目前流行的毒株主要以O型为主,其次为A型。2011年东南亚O/Mya/98株的侵袭导致东亚国家如中国、日本、蒙古、俄罗斯和韩国的猪大规模口蹄疫爆发,O型口蹄疫病毒的新猪毒-2株也存在中国的一些地区和周边国家。目前猪O型口蹄疫灭活疫苗制苗毒株为O/MYA/98/BY/2010株（Mya-98谱系）和O/GX/09-7株+O/XJ/10-11株。本研究将讨论HEV ORF2结构C末端在形成VLPs过程中的作用,并筛选出最佳的HEV候选疫苗,进而开发一种HEV与FMDV的联合疫苗既可以预防猪口蹄疫,又可避免猪感染HEV,从源头控制人戊型肝炎的感染,达到预防和控制人戊型肝炎的目的。一、HEV ORF2不同截短蛋白的质粒构建与原核表达基因工程疫苗研究所主要研究HEV ORF2相关C端的蛋白结构,p179、p216、p222和p231蛋白为基因工程疫苗研究所保存,蛋白p216、p222和p231在天然状态下呈现的聚体形态和VLPs与蛋白p179有一定差异性,因此根据截短片段的差异又表达了5个不同N端和C端截止的ORF2蛋白片段p188、p196、p189、p199和p209,分析形成多聚体的关键氨基酸。结果如下:1.1原核大肠杆菌成功表达p188、p196、p189、p199和p209蛋白,均为可溶性蛋白,通过His标签纯化技术成功获得高纯度蛋白溶液。1.2非还原SDS-PAGE和Western blot结果显示C末端截止到aa617的p179、p188和p196蛋白均表现为二聚体形态和极少量四聚体,且与单克隆抗体5G5反应;而N端固定到aa439,C端有不同延伸的p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白均形成多聚体,且多聚体都与单克隆抗体5G5反应。表明aa618-627为形成多聚体形态结构的关键氨基酸区域。1.3透射电镜观察蛋白多聚体与VLPs的形成有直接关系。C末端延伸超过aa627的蛋白p189、p199、p209、p216、p222和p231形成颗粒数目多且具有明确的球形结构;而蛋白p179、p188和p196的颗粒结构不太稳定,数目较少。2.ORF2截短蛋白组装VLPs的结构分析为研究多聚体和VLPs形成的原因,进一步分析横跨aa618-627结构域的第二组蛋白,并验证参与形成多聚体和VLPs的氨基酸。原核表达pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626一系列重组蛋白,蛋白p179和p189作为对照进行分析;此外,将p189蛋白中Cys627突变为Ala即p189A,p199蛋白中Cys627和Cys630突变为Ala即p199A,p222蛋白中Cys627、Cys630和Cys638均突变为Ala即p222A,深入验证Cys在蛋白形成多聚体和VLPs中的重要作用。结果如下:2.1蛋白pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626均成功表达,非还原SDS-PAGE和Western blot结果表明p179、pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626为二聚体,而p189为多聚体形态,提示Cys627为关键氨基酸,在蛋白多聚体形成过程中发挥重要作用。2.2突变蛋白p189A、p199A和p222A的形态仅表现为二聚体和少量四聚体,而未突变的三个蛋白呈多聚体形态,突变前后有显著差异;还原剂DTT处理9个蛋白后,非还原SDS-PAGE和Western blot结果表明p179、p188和p196蛋白呈现为二聚体形态不变,而p189、p199、p209、p216、p222和p231由多聚体形态转化为二聚体和少量四聚体,这些结果提示蛋白多聚体组装形成中含有二硫键。2.3透射电镜观察结果显示p179、p188、p196三个蛋白形成的病毒样颗粒数目较少,且颗粒形态不明显;p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白可观察到大量病毒样颗粒,且立体结构明显,与天然病毒形态更加接近;DTT处理后,颗粒形态被破坏,数目减少。提示多聚体可通过一定的组装方式形成病毒样颗粒,并且二硫键具有稳定颗粒形态的作用。2.4还原剂TCEP处理前后,通过动态激光散射实验评估不同VLPs的粒径和粒径分布,蛋白p189和p222粒子的大小明显减小,阴性对照p179 VLPs几乎无变化;散射光强度结果表明p189和p222 VLPs中加入还原剂后其强度明显降低,而p179VLPs则无变化。2.5 HEV单克隆抗体5G5与免疫磁珠结合并分离粪便HEV病毒粒子,在透射电镜下观察正常HEV病毒颗粒直径约为40nm。DTT处理样品后,电镜下则观察不到HEV颗粒,有可能在DTT还原作用下病毒衣壳被解聚。2.6用Phyre2 server在线预测p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白二聚体结构,用Py Mol software展现蛋白3D结构,观察Cys627、Cys630和Cys638在二聚体结构中的位置。从Gen Bank下载162个HEV 1﹑2﹑3﹑4基因型及不同宿主来源的HEV毒株的序列,利用生物信息学软件MEGA 5进行氨基酸序列比对,确定pORF2的C端Cys627、Cys630和Cys638的保守性。3.HEV-FMDV联合疫苗的制备和免疫原性研究通过分析不同HEV ORF2截短蛋白的抗原性、稳定性、形成VLPs以及免疫原性等,选择最佳HEV疫苗候选;将HEV重组疫苗与口蹄疫灭活疫苗进行交叉配比,制备不同配比HEV-FMDV联合疫苗,并对其免疫原性进行初步研究。为了能进一步检测出联合疫苗免疫Balb/C小鼠中产生的FMDV抗体IgG水平,采用基因工程技术,表达FMDV VP1上G-H环中和抗原表位重组蛋白,用于检测FMDV特异性抗体。结果如下:3.1蛋白稳定性结果表明在高温37℃环境下p179和p222两个蛋白稳定性最好;ElliproWeb服务器计算p179和p222蛋白关键抗原表位的突出指数,曲线下面积（AUC）结果表明p222高于p179;单克隆抗体5G5分别与p179和p222两种抗原进行反应,两者均有较高的抗原反应性;相同剂量同一条件下p179和p222免疫小鼠,HEV抗体IgG结果显示p222免疫原性高于p179,具有显著性差异（p=0.007**）。因此,p222重组疫苗作为联合疫苗中HEV最佳候选疫苗。3.2根据FMDV灭活疫苗中所含O/GX/09-7毒株和O/Mya98/XJ/2010毒株,设计可以检测两种毒株的抗原LMYA-GX,将O/GX/09-7毒株VP1上G-H环中和抗原表位aa132-160与O/Mya98/XJ/2010病毒株的VP1上G-H环中和抗原表位aa132-160串联为LMYA-GX（132-160aa-GG-132-160aa）,连接到载体p GEX-4T-2,转化大肠杆菌并成功表达与纯化。3.3 HEV单独组和FMDV单独疫苗组中HEV抗体IgG和FMDV抗体IgG检测:1)间接ELISA法检测FMDV灭活疫苗三种不同浓度（0.5,1,2μg/ml）免疫小鼠的血清FMDV-IgG抗体。所有免疫小鼠在第2周均检测到FMDV-IgG抗体。F0.5疫苗组的抗体滴度在第6周达到最高水平,F1和F2组的抗体滴度在第10周达到最高水平。在整个实验中,F0.5组的抗体滴度均低于其他两组。F1组和F2组在前4周不呈剂量依赖性:F1组在第2周和第4周的FMDV-IgG抗体水平比F2组FMDV-IgG抗体水平高,在第10周两组的水平相似。2)HEV-p222重组疫苗不同剂量（25,50,100μg/ml）免疫小鼠,间接ELISA分析HEV抗体IgG滴度。各组在第2周均未检测到抗HEV抗体,从第4周开始,疫苗组HEV特异性IgG开始增加,第10周E25和E100组达到最高水平,第12周E50组达到最高水平,无剂量依赖性。第4周,E25和E100组抗体滴度比E50组高4倍。在第10周,E25组抗HEV抗体滴度比E50组高5倍,比E100组高2倍。因此,1μg/ml FMDV灭活疫苗和25μg/ml HEV-p222重组疫苗被选择用于制备不同交叉配比的HEV-FMDV联合疫苗。3.4 HEV-FMDV联合疫苗组中HEV抗体IgG和FMDV抗体IgG检测:1)选择1μg/ml FMDV免疫原与三种不同剂量HEV-p222重组疫苗（25,50,100μg/ml）联合制备,即F1+E25,F1+E50,F1+E100,肌内注射小鼠,监测FMDV特异性抗体IgG。结果表明三个联合疫苗组抗FMDV抗体水平均显著高于FMDV灭活疫苗单独组F1。2)选择25μg/ml HEV-p222免疫原与三种不同剂量的FMDV灭活疫苗（0.5,1,2μg/ml）联合制备,即E25+F0.5,E25+F1和E25+F2,肌内注射小鼠。监测HEV-IgG的产生,结果表明HEV-FMDV联合疫苗组诱导体液反应比HEV单独组（E25）更强;在12周的实验中,E25+F0.5组的抗-HEV抗体滴度最高,其次是E25+F2和E25+F1组。综上所述,我们的研究结果表明:1.p179、p188和p196蛋白为二聚体,而p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白为多聚体形态,表明aa618-627为形成多聚体形态结构的关键氨基酸区域。p179、p188、p196蛋白在电镜下观察所形成的VLPs数目较少,形态结构不明显;p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白形成VLPs数目较多,颗粒较为均匀,结构明显。2.通过进一步表达pC618～pC626等一系列重组蛋白,发现Cys627为形成多聚体和VLPs的关键氨基酸。采用非还原SDS-PAGE、Western blot、DLS、透射电镜TEM等技术,加还原剂DTT或TECP以及突变蛋白中Cys为Ala来验证多聚体或VLPs中存在的二硫键,且二硫键主要连接二聚体与二聚体,表明Cys的重要性。天然HEV病毒衣壳中也有可能含有二硫键,以增强衣壳蛋白结构的稳定性。用生物信息学预测二聚体结构并显示C末端三个Cys位于二聚体结构外侧边缘;且162个HEV毒株蛋白序列比对表明Cys627、Cys630和Cys638高度保守,保守率为99.4%、100%和100%。3.首先筛选出最佳HEV重组疫苗,通过蛋白稳定性、中和抗原表位突出AUC、抗原性、形成VLPs、以及免疫原性等多方面评估,HEV-p222蛋白作为HEV-FMDV联合疫苗的候选疫苗。4.将HEV-p222重组疫苗和FMDV灭活疫苗分别设计3个不同剂量,首先研究两者的免疫原性,优选出最佳免疫剂量,进行联合疫苗配比制备;将HEV-p222重组疫苗和FMDV灭活疫苗进行不同的剂量配比,分为F1+E25、F1+E50、F1+E100、F2+E25和F0.5+E25（μg/ml）等5组联合疫苗组进行免疫原性研究,并与HEV单独组和FMDV单独组进行比较,观察评估两种免疫原之间的干扰情况,结果表明两种抗原之间不存在免疫原性的相互影响,并具有免疫原性的协同效应。